TD N 03 de microbiologie, Univ d'Oran IGMO : Isolement et purification

TD N 03 : Isolement et purification
Par Messaoui Naima

1. Principe
Isoler consiste à séparer les divers microorganismes d'un mélange.
L'isolement permet :
• d'isoler une ou plusieurs souches contenues dans un mélange : il y aura autant de colonies différentes que de souches différentes.
•    de vérifier la pureté d'une souche étudiée : une souche pure ne donnera qu'un type de colonie.
L’isolement peut être réalisé par épuisement, en étalant le produit initial à la surface d’un milieu solide approprié.
Pendant l’incubation, chaque micro-organisme déposé se multiplie pour donner un clone de cellules identiques. Lorsque les micro-organismes sont suffisamment éloignés, le clone se développe abondamment pour produire une colonie. Une colonie correspond à un amas de cellules identiques à la cellule mère.
Pour réussir un isolement, il faut donc parvenir à disperser suffisamment les cellules microbiennes (dimension de l’ordre du µm) pour que, après croissance, les colonies (dimension de l’ordre du mm) qui en sont issues ne se touchent pas. (Pour cela, on utilise souvent des dilutions)


2.Isolement de colonies pures ou la purification
L'objectif de l'isolement et de la purification est donc d'obtenir pour chaque micro-organisme différent des colonies distinctes.
Les colonies obtenues, en étalant une souche pure, doivent toutes présenter les mêmes caractères. A l'opposé, l'isolement d'un mélange donnera autant de colonies différentes que de micro-organismes différents contenus dans ce mélange.
Notez : deux colonies de même aspect et de mêmes caractères ne contiennent pas forcément des micro-organismes identiques


3. Techniques d’isolement
Selon le conditionnement, on utilisera différentes méthodes.

 Le matériel
Avant toute manipulation, il faut rassembler tout le matériel dont on a besoin. On l’organise selon le schéma suivant.
 



En milieu liquide
-- On plonge l’oëse dans la suspension bactérienne réalisée à partir d’une colonie ou plusieurs colonie que l’on veut identifier ou confirmer.
-- On la retire sans toucher les parois du tube. L’anneau contient une bulle de suspension avec des bactéries.
-- On plonge ensuite l’oëse dans le tube de bouillon. Et on l’agite sur toute la hauteur afin de répandre la suspension dans tout le milieu.
-- On referme le tube et on peut le placer en incubation.
On prendra garde à conserver tous les objets dans la zone stérile du bec Bunsen et de ne jamais les faire entrer en contact avec la paillasse.
Les embouts des tubes seront passés à la flamme avant et après toute manipulation, tout comme les instruments.


En tube



L’ensemencement se fait par piqûre centrale au fil droit après avoir préalablement chargé celui-ci de suspension.

En tube étroit

Les tubes étroits sont ensemencés grâce à une pipette Pasteur. Une pipette Pasteur est une canne de verre, cotonnée aux deux extrémités, afin de maintenir l’extérieur stérile. On l’étire à la flamme du bec Bunsen pour l’affiner en son centre. On étire dans la flamme jusqu’à rupture. On sépare les deux parties.



Quand elle est réussie, elle est longue et assez fine pour atteindre le fond du tube. Il est préférable de la boutonner : créer une petite boule de verre à l’extrémité de l’étirement en la travaillant à la flamme




On ensemence de tube du fond vers la surface, en réalisant un mouvement hélicoïdal, la suspension bactérienne est libérée progressivement. La pipette est à usage unique et éliminée via la poubelle pour produits contaminés.


En gélose inclinée



On utilise l’oëse chargée de suspension selon le procédé décrit pour le milieu liquide. On réalise des stries sur toute la longueur de la pente en commençant au fond du tube ; en remontant, il faut espacer les stries pour " étaler " la suspension.


En culot + pente



Le culot est classiquement inoculé au fil droit et la pente à l’oëse selon le principe de la gélose inclinée.


En boite de Pétri

Ce mode de culture observe plusieurs variantes de techniques d’ensemencement.
-- Par inondation. Quelques mL de suspension sont déposés à la surface de la gélose, on la recouvre totalement. L’excès est éliminé.
-- Par étalement. Utilisé en dénombrement, un volume précis de suspension (en général 100µL) est déposé à la surface de la gélose. La goutte d’inoculum est ensuite étalée au râteau ou avec des billes de verre stériles que l’on retire ensuite de la boite avant l’incubation.
-- Par la méthode des doubles couches. La gélose est inoculée par étalement puis on coule une deuxième couche de gélose en fusion par dessus la première. On crée ainsi une zone microaérobie.
-- Par incorporation dans la gélose. On incorpore une quantité connue de suspension à la gélose en fusion. Après homogénéisation, on coule en boite de Pétri et on laisse solidifier.
-- Par stries d’épuisement. On dépose l’inoculum au bord de la boite. A partir de là, on l’étale à l’aide d’une oëse selon la méthode des cadrans.



1. Faire un point au marqueur sur le fond de la boite pour repérer le premier dépôt
2. Etaler une oëse de culture au niveau du point en faisant des stries serrées toujours dans le même sens. Flamber l’oëse
3. Faire des stries serrées toujours dans le même sens en repassant dans le premier dépôt. Flamber l’oëse
4. Répéter l’opération (3) comme indiquer sur schéma. Finir par quelques stries ne recoupant pas le dépôt précédent. Flamber l’oëse.


Par filtration sur membrane.



On filtre un échantillon d’eau et on le pose sur la gélose de la boite de Pétri.


4. L’incubation

L’incubation est le temps et la température qui vont être adoptés pour une croissance optimale de la population bactérienne voulue.
En hygiène de l’eau, trois températures sont appliquées.
22°C car elle caractérise les bactéries adaptées à la température de l’eau. Elles ne sont donc potentiellement peu ou pas d’origine fécale.
37°C car il s’agit de la température du corps humain. Les bactéries issues du tube digestif se développent très bien à cette température pour peu que le milieu de culture soit adapté. On peut ainsi présumé une pollution d’origine fécale et donc la présence de germes pathogènes.
44°C car seuls les germes pathogènes sont adaptés à cette température. Les germes autochtones ne résistent pas pendant tout le temps d’incubation.

On place les boites et les tubes dans une étuve qui va réguler et maintenir la température durant toute la période nécessaire.
Le temps d’incubation est variable d’un germe à l’autre. On a généralement des durées variant de 24h à 72h maximum. Ça ne sert à rien d’attendre plus. Toutes les bactéries viables présentes se seraient développées.



Une vidéo animée de l’isolement :