TD2 : Les milieux de culture en microbiologie
Par : Messaoui Naima
1.Introduction
Un milieu de culture, constitué à partir de substances biologiques ou chimiques, reproduit un environnement favorable (nutriments, pH, pression osmotique ...) à la culture d'un certain type de micro-organismes.
Ces milieux sont utilisés par les microbiologistes pour : isoler, produire, identifier .... les micro-organismes.
2.Composition des milieux de culture
a-Fondamental :
Un milieu de culture doit contenir :
Des nutriments couvrant les besoins élémentaires en macro-éléments, micro-éléments et oligoéléments, les besoins énergétiques et les besoins spécifiques.
La composition d'un milieu dépend donc du type trophique du micro-organisme à cultiver.
b- D'autres substances (plus ou moins facultatives) :
·Substances tampons : maintien du pH plus ou moins constant (souvent source de macro-éléments)
·NaCl et autres minéraux : maintien de l'isotonicité par rapport au milieu intracellulaire (source de micro-éléments)
·Agents inhibiteurs : inhibition d'un groupe microbien, sélection des autres
·Indicateurs : non toxiques pour les micro-organismes, ils révèlent la présence de produits issus du métabolisme.
| Inhibiteurs | Microorganismes non inhibés | Microorganismes inhibés |
| ANC (Acide nalidixique-colimycine) | Bactéries Gram+, bacilles Gram – résistants ANC | Bacilles Gram - sensibles |
| Azide | Streptococcus, Enterococcus, Lactococcus et Listeria | (*) ... |
| Cétrimide | Pseudomonas aeruginosa et apparentés | (*) ... |
| Chloramphénicol | Champignons | Bactéries (sensibles) |
| Chlorure de sodium haute concentration | Staphylococcus, Micrococcus, Corynébactéries, Enterococcus | Gram -, Streptococcus |
| Cristal violet | Gram - | Gram + |
| Désoxycholate (sels biliaires) | Gram -, Enterococcus | Gram + |
| Gentamicine | Champignons | Bactéries (sensibles) |
| Polymixine B | Brucella, Bacillus cereus | (*) ... |
3.Les deux grands types de milieux de culture
Suivant l'origine des constituants d'un milieu de culture on peut distinguer : les milieux synthétiques (ou définis) et les milieux empiriques (ou naturels ou complexes).
3.1.Les milieux synthétiques ou définis
Attention :
Milieux constitués de substances chimiques pures, leur composition qualitative et quantitative est rigoureusement connue.
Ce sont des milieux relativement pauvres.
Complément : Utilisation :
·Pour les micro-organismes autotrophes (Cyanobactéries / milieu BG11)
·Pour étudier les besoins nutritifs d'un micro-organisme : besoins en facteurs de croissance auxanogramme
·Pour les dosages par voie microbiologique : acides aminés, vitamines (cf TP dosage de la vitamine B12 )
·Pour la mise en évidence de certains caractères biochimiques (Citrate ed Simmons, uréase)
3.2.Les milieux empiriques
Attention :
Milieux de composition approximative car ils contiennent des composants indéfinis comme des peptones, des extraits de viande, des extraits de levures, des liquides biologiques.
Ce sont des milieux très riches en substances organiques permettant une croissance aisée de nombreux micro-organismes .
Ces différents composants mal définis vont couvrir les besoins en macro-éléments en micro-éléments et en oligoéléments ainsi que les besoins en énergie et spécifique pour les micro-organismes chimio-organotrophes, hétérotrophes et auxotrophe.
Fondamental :
Les peptones : Sont obtenues suite à l'hydrolyse chimique et/ou enzymatique (protéases) de matières biologiques riches en protéines (viande, végétaux, levure, protéines ...).
La composition d'une peptone dépend donc de la matière protéique de départ et du traitement hydrolytique.
Les peptones présentent entre elles des grandes différences de composition en acides aminés et oligopeptides, bases azotées, vitamines, ions minéraux et voire glucides.
Les peptones sont de deux types : les peptones simples résultant de l'hydrolyse d'un seul substrat protéique (peptones pepsiques de viande, peptones trypsiques de caséine, peptones de levures ...) et les peptones composées résultant de l'hydrolyse de plusieurs substrats protéiques ou de mélanges de peptones simples ( polypeptones, tryptones ...)
Les extraits de viande (ou peptones de viande) :
Ce sont des extraits aqueux de viande bovine maigre. L'extrait de boeuf contient acides aminés, peptides, nucléotides, acides organiques, vitamines et minéraux.
Les extraits de levures (ou peptones de levures) :
L'extrait de levure est une excellente source de vitamines (notamment les vitamines B) aussi bien que de composés azotés et carbonés.
Les liquides biologiques :
Certains milieux empiriques sont de plus enrichis en liquide biologique : sang, sang cuit, sérum, lait etc...
4.Les milieux de culture selon leurs usages
4.1.Les milieux dits "de base" ou usuels
D'un emploi aussi universel que possible, milieu ou cultive un maximum de micro-organismes hétérotrophes ne présentant pas d'exigences nutritives particulières.
Un micro-organisme cultivant sur ce type de milieu est dit de culture facile ou non exigeant (ce qui ne l'empêche pas d'être éventuellement auxotrophe vis-à-vis de facteurs de croissance apportés par les peptones des milieux ordinaires)
Exemple : Gélose ou bouillon ordinaire ou nutritive. Bouillon trypticase soja
4.2.Les milieux d'isolement
Ils sont caractéristiques du micro-organisme recherché et sont solides (présence d'agar à 15g/L = polygalactoside sulfaté, extrait d'algues rouges, non dégradable par la plupart des micro-organismes, liquide à >45°C et solide à <45°C).
Complément :
a-Milieux de Base : précédemment cités.
Milieux enrichis de produits biologiques, par exemple : milieux de base plus du sang (gélose au sang frais).
b-Milieux sélectifs : favorisant la croissance d'une (ou de quelques) espèces bactériennes (exemple : la gélose à pH 9).
Milieux sélectifs : milieu de base contenant un ou plusieurs agents sélectifs qui sont des inhibiteurs pour les micro-organismes que l'on désire éliminer (exemples : la gélose Drigalski, la gélose Chapman mannité ...).
c-Les milieux d'enrichissement
Ce sont des milieux liquides ou solides favorisant la croissance du micro-organisme recherché (substrats spécifiques et/ ou conditions de cultures particulières).
Après incubation on obtient une culture enrichie en micro-organismes recherchés.
Cet enrichissement est notamment utilisé pour les micro-organismes de l'environnement (Cf. la colonne de Winogradsky).
Les milieux d'orientation et d'identification
Ces milieux permettent la mise en évidence de caractères biochimiques .
Remarque : Les milieux d'isolement (sélectifs ou non) permettant la mise en évidence d'un caractère biochimique et donc distinguant différentes catégories de micro-organismes sont aussi appelés des milieux différentiels
d-Les milieux de conservation
Ces milieux permettent la survie des micro-organismes utilisant un métabolisme ralenti. Il s'agit en général de milieux très pauvres.
Les milieux de culture utilisés dans une unité biotechnologique (fermenteur)
La grande majorité des micro-organismes industriels sont chimio-organotrophes et hétérotrophes. Il est donc nécessaire d'apporter dans le milieu :
ØUne source d'énergie et de carbone : cette source provient d'un glucide facilement assimilable tel que le glucose ou au contraire lentement métabolisable tel que l'amidon. On peut aussi utiliser des mélasses (mélanges de glucides issu de l'industrie du sucre ).
ØUne source azotée : soit inorganique comme (NH4)2SO4, KNO3, soit organique comme l'asparagine, le succinate d'ammonium, le glutamate, l'urée soit complexe comme les peptones, les farines de soja.
ØDes sels minéraux (K2HPO4 ou KH2PO4 ; MgSO4,7 H2O ; CaCl2).
ØDes oligo-éléments (fer, zinc, manganèse, cuivre, cobalt, molybdène).
ØCertains organismes ont de plus des besoins supplémentaires. Par exemple de nombreux champignons exigent de la biotine et de le thiamine.
ØDe plus la production optimale de certains métabolites n'est atteint qu'avec des additifs (précurseurs, huile ...).
5.Préparation des milieux de cultures
Les milieux de culture peuvent être :
a- Commercialisés : « prêts à l'emploi », « prêts à couler » ou en poudre (mélange complet des constituants de base) ;
b-Préparés en mélangeant les différents composants le constituant (cas des milieux synthétiques).
La préparation nécessite une stérilisation (non exclusive) :
par autoclavage (15 à 20 minutes à 120°C)
par filtration si certains composants sont thermolabiles.
6.Méthode : Exemple de protocole
1.Évaluer le volume de milieu nécessaire,
2.Mesurer la masse nécessaire de poudre et d'éventuels additifs,
3.Mettre les poudres en suspension dans un volume de diluant inférieur au volume nécessaire,
4.Chauffer pour dissoudre si nécessaire en agitant (à ébullition en général),
5.Ajouter le complément de diluant.
6.Rectifier le pH par addition de NaOH ou HCl à 1 ou 0,1 mol.dm-3 à l'aide d'un pH-mètre, sauf si le fabricant indique le contraire
7.Conditionner, en prenant garde à la solidification d'un milieu contenant de l'agar et en respectant les contraintes de volumes pour certains milieux.
Stériliser, éventuellement à l'autoclave ou par filtration, assez rapidement après la fabrication.
6.1.Conditionnement
Les milieux peuvent être conditionnés en :
Tubes de faible diamètre et courts ou longs (VF) ;
Tubes normaux (18 mL maximum) ;
Tubes de grands diamètres ;
Flacons (intéressant pour les milieux à couler en boîte) (classiquement au lycée nous utilisons des flacons de 125 mL, contenant : 100 mL de milieu pour couler ≈ 6 géloses) ;
Boites de Pétri (conservation limité au réfrigérateur ou en chambre froide, boites retournées pour éviter la condensation sur le couvercle).
Des bouchons à vis étanches sont préférables au coton pour éviter la déshydratation.
Dans certains cas, le volume de milieu doit être respecté scrupuleusement : gélose antibiogramme, tubes de diluants pour dilutions en série ...
7.Quelques milieux de culture et leurs compositions
7.1.Gélose nutritive
En biologie, la gélose nutritive ou gélose nutritive ordinaire (GNO) ou encore gélose ordinaire est un milieu d'isolement non-sélectif.
L'isolement est réalisé dans le but de contrôler la pureté d'une souche bactérienne (pur s'il y a un type de colonie sur la gélose) ou de purifier la souche bactérienne si elle est contaminée.
L'isolement permet de séparer des micro-organismes différents dans un mélange qui pourront être ainsi étudiés individuellement.
Sur cette gélose nutritive on observe le nombre de colonies différentes (nombre de type de colonies) et on fait une description des colonies isolées.
Composition
Extrait de viande 1,0g/L
Extrait de levure 2.5g/L
Peptone 5,0g/L
Chlorure de sodium 5,0g/L
Agar 15,0g/L
pH = 7,0
7.2.Bouillon lactosé au BCP
Aspect du milieu avant utilisation | Aspect du milieu après utilisation |
| |
Le bouillon lactosé au pourpre de bromocrésol (BCP) est utilisé comme milieu présomptif de détection des bactéries coliformes dans l’eau.
PRINCIPES
- La Tryptone et l’extrait de viande apportent les éléments nutritifs azotés nécessaires à la croissance des bactéries.
- La fermentation du lactose est mise en évidence par l’acidification du milieu qui provoque le virage au jaune de l’indicateur pH (pourpre de bromocrésol), ainsi que par la production de gaz dans les cloches de Durham.
- Pour confirmer la présence de coliformes, il est nécessaire de pratiquer des subcultures sur les milieux confirmatifs appropriés.
7.2.1. PREPARATION
Milieu simple concentration
- Mettre en solution 13,0 g de milieu déshydraté (BK119) dans 1 litre d’eau distillée ou
déminéralisée.
- Agiter lentement jusqu’à dissolution complète.
- Répartir en tubes 16 x 160 mm contenant une cloche de Durham, à raison de 10 mL par tube.
- Stériliser à l’autoclave à 121°C pendant 15 minutes.
- Après refroidissement, les cloches de Durham ne doivent pas contenir d’air.
Milieu double concentration
- Mettre en solution 26,0 g de milieu déshydraté (BK119) dans 1 litre d’eau distillée ou
déminéralisée.
- Agiter lentement jusqu’à dissolution complète.
- Répartir en tubes 20 x 200 mm contenant une cloche de Durham, à raison de 10 mL par tube.
- Stériliser à l’autoclave à 121°C pendant 15 minutes.
FORMULE - TYPE
(Pouvant être ajustée de façon à obtenir des performances optimales)
Pour 1 litre de milieu :
- Tryptone...........................................................................................5,0 g
- Extrait de viande ..............................................................................3,0 g
- Lactose ............................................................................................5,0 g
- Pourpre de bromocrésol..............................................................25,0 mg
7.3.Kligler-Hajna
Le milieu de Kligler-Hajna est un milieu de culture permettant la recherche simultanée de :
L'utilisation du lactose ;
La fermentation du glucose ;
La production d'H2S ;
La production de gaz ;
La lysine décarboxylase.
La B-galactosidase pour les bactéries lactose - (test ONPG)
Composition
- Peptone ......................... 15 g
- Extrait de viande ............... 3 g
- Extrait de levure ............... 3 g
- Peptone pepsique de viande ...... 5 g
- Glucose ......................... 1 g
- Lactose ......................... 10 g
- Rouge de phénol ................. 25 mg
- Chlorure de sodium .............. 5 g
- Sulfate ferreux.................. 0,2 g
- Thiosulfate de sodium ........... 0,3 g
- Agar-agar ....................... 11
pH = 7,5
Les peptones sont riches en lysine. Le milieu est conditionné en tubes avec une pente et un culot.
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Mar 10 Fév 2015 - 19:20
