biologie moléculaire M1BE, sujets d'exam

Sujet II (Denise Aragnol), durée conseillée 1h
Librement inspiré de Daury et al., embo reports, octobre 2005 et Nicolas et al., Mol Cel Biol, mars 2003.

dhfr sert de modèle pour étudier l’activation des gènes cibles de E2F en relation avec la position des cellules dans le cycle cellulaire. dhfr est activé à la fin de la phase G1 et pendant la transition G1/S. Les études sont menées en culture de cellules humaines qu’il est possible de synchroniser. En effet, un sevrage en sérum dans le milieu de culture conduit à bloquer les cellules majoritairement en phase G0. L’ajout de sérum permet alors de ré-induire, de façon contrôlée, la poursuite du cycle cellulaire. Ainsi, 12h après l’addition du sérum la majorité des cellules se trouve en G1/S. Le locus du gène dhfr , ainsi que les outils moléculaires disponibles sont représentés dans la figure 1 .

1-En utilisant ce système expérimental, par quelle expérience pourriez-vous montrer que dhfr est inactif en G0 et actif en G1/S (plusieurs réponses justes sont possibles, choisissez en une) ? Proposez une figure légendée donnant le résultat de cette expérience.

Récemment le locus dhfr a été utilisé pour étudier le rôle joué par les modifications des histones dans la régulation des cibles d’E2F. En particulier, l’acétylation et la méthylation des histones H3 localisées au promoteur de dhfr (région DHFR-P de la figure 1) ont été analysées en fonction de la position des cellules dans le cycle cellulaire. L’expérience mise en œuvre est une immunoprécipitation de chromatine (ChIP) réalisée avec des anticorps spécifiques soit de l’histone H3 acétylée sur la lysine 9 (K9 Ac), soit de H3 acétylée sur K14 (K14 Ac), soit de H3 méthylée sur K9 (K9 met). Les résultats de cette expérience sont montrés dans la figure 2. Les cellules utilisées dans l’expérience sont majoritairement soit en phase G0 (en gris), soit en phase G1/S ( en noir).

2-Rappelez les étapes importantes des ChIP réalisées pour cette expérience.

3-Pourquoi les résultats de la figure 2 sont-ils en accord avec ce que l’on sait actuellement de l’acétylation et de la méthylation d’H3 ?

4-De façon générale, quels mécanismes peut on imaginer pour expliquer la déméthylation des histones au niveau d’un locus ?

Par la suite, deux séries d’expériences de ChIP ont été réalisées sur des cellules majoritairement en phase G1/S. Dans la première série, l’anticorps utilisé reconnaît H3 et l’ensemble de ses variants. Les résultats sont présentés dans la figure 3. Dans la deuxième série, les cellules utilisées expriment de façon permanente un variant H3.3 fusionné à un tag HA (HA-H3.3). L’anticorps utilisé est, dans ce cas, dirigé contre le tag HA. Les résultats sont présentés dans la figure 4.

5-Que pouvez-vous conclure de ces expériences ?

MASTERS M1 BE, BV, BBSG
Epreuve de BIOLOGIE MOLECULAIRE
Deuxième session 2006. 2 heures, sans document ni calculette.

Sujet de D. Aragnol

Les expériences d’immunoprécipitation de chromatine (ChIP) dont les résultats sont montrés dans la figure 1 ont été réalisées en utilisant des anticorps spécifiques respectivement de l’histone H2B (H2B), de l’histone H2A (H2A(K5)) ou du variant H2A.Z (H2A.Z). Le gène étudié (fig1A) est c-myc dont l’expression, dans la lignée cellulaire humaine HL60 peut être induite par l’addition d’IL2. Le gène gapdh (fig1B), est constitutivement exprimé dans cette lignée cellulaire. Les histogrammes indiquent un enrichissement relatif, calculé en utilisant, pour définir le niveau de référence de base, des primers spécifiques d’un gène inactif (ref), dans cette lignée cellulaire.

1-Qu’est ce qu’un variant d’histone ?

2-Rappeler le principe d’une expérience de ChIP ? Que représentent les éléments b, e, g, i, l , m, n, o qui apparaissent dans la partie A de la figure 1. Enfin, vous expliquerez ce que représente la partie supérieure de cette partie A de la figure 1 (au dessus des histogrammes)

En ce qui concerne les ChIP dont les résultats sont montrés dans la figure 2, ils ont été réalisées en utilisant des anticorps spécifiques respectivement de la lysine 4 (K4) méthylée de l’histone (H3), de la lysine 79 (K79) méthylée de H3, de la lysine 36 (K36) méthylée de H3. Les gènes bcl-6 et bcl-2 sont constitutivement exprimés dans les cellules HL60. Les histogrammes indiquent un enrichissement relatif, calculé en utilisant, pour définir le niveau de référence de base, des primers spécifiques du gène ref.

3-Comment interprétez vous les résultats présentés dans les figures 1 et 2 dans le contexte de l’hypothèse d’un code histone.

FIGURE 1 :

juin 06 [Ms Word, 60K]