BIOLOGIE MOLECULAIRE (cours)

Durant cette phase :

les chromosomes dépourvus de microtubules kinétochoriens se décondensent;

les microtubules polaires arrêtent leur élongation;

l'enveloppe nucléaire se reforme autour des chromosomes individuels;

le sillon de division sépare la cellule en deux, sous l'action d'un
anneau contractile intracellulaire formé d'actine et de myosine qui est
attaché à des protéines de la membrane cytoplasmique


Dans les cellules animales, la cytocinèse débute pendant la
télophase, avec l´apparition du sillon de division, une invagination de
la surface cellulaire à l´endroit occupé précédemment par la plaque
équatoriale ; la cellule semble subir un étranglement centripète duquel
naîtront deux nouvelles cellules complètes et séparées.

Dans les cellules végétales, dotées d'une paroi cellulosique, la
cytocinèse apparaît comme un mécanisme centrifuge. Une double structure
appelée plaque cellulaire se constitue pendant la télophase à l´équateur
de la cellule mère, à partir du centre et rejoint la paroi de la
cellule-mère originelle avec laquelle elle fusionne ; les deux nouvelles
cellules végétales sont nées.

II. MEIOSE

La méiose est une division cellulaire réductionelle, c'est à dire, le
nombre de chromosomes par cellule fille sera réduit par la moitié. Par
exemple, les cellules humaines on 46 chromosomes par cellules. C'est le
nombre diploide de chromosomes (2n=46). Les gamètes par contre
contiennent la moitié de ce nombre de chromosomes et sont dits
haploiides (n=23). C'est lors de la production des gamètes par le
processus de méiose que le nombre de chromosomes est réduit. La méiose,
bien qu'elle ressemble à la mitose, a donc la fonction de produire des
cellules haploides.

Il est essentiel de réduire par la moitié le nombre de chromosomes
dans les gamètes puisque deux gamètes se fusionnent pour produire le
zygote qui deviendra l'embryon qui se développera en adulte. Quand les
deux gamètes se fusionnent le nombre de chromosomes total doit être égal
au nombre de chromosomes d'une cellule diploide. Donc chez les humains,
le spermatozoides (23 chromosomes) se fusionne avec l'ovule (23
chromosomes) pour produire le zygote qui aura 46 chromosomes.

La méiose se fait en deux étapes, la méiose I qui est la phase
réductionnelle, et la méiose II qui est une phase équationnelle. C'est
durant la méiose I que les chromosomes homologues sont séparés pour
produire deux cellules filles ayant la moitié des chromosomes. Ces
chromosomes sont par contre dédoublés (deux chromatides soeurs) et la
méiose II sépare ses chromatides soeurs pour produire 4 cellules filles
haploides. Les étapes de la méiose sont présentés ci-dessous.

MÉIOSE I - PHASE RÉDUCTIONELLE.

PROPHASE I

DÉBUT PROPHASE

Les chromosomes deviennent visibles en forme de longs filaments.

La réplication de l'ADN s'est fait durant l'interphase.

MI-PROPHASE

Les chromosomes homologues deviennent plus courts et plus épais et se synapsent.

Le crossing-over se fait. Le crossing over est un échange réciproque
entre les chromosomes homologues. La fonction du crossing-over est
d'offrir un plus grande diversité génétique à la progéniture.

FIN-PROPHASE

La structure tétrade (les chromosomes homologues en synapse) devient visible.

La membrane nucléaire commence à disparaître.

Les kinétochores se forment.

METAPHASE I

Chaque paire de chromosomes homologues se dirige vers la plaque équatoriale de la cellule.

ANAPHASE I

Les centromères ne se séparent pas.

Chaque chromosome de chaque paire d'homologues, se dirige vers un
pôle opposé, alors il y a eu une réduction du nombre de chromosomes.

TELOPHASE I

Un nouveau noyau haploïde se forme dans les deux nouvelles cellules.

Les chromosomes disparaissent de vue.

La cytocinèse est presque complète.

INTERCINÈSE

Il y a maintenant deux cellules haploïdes, avec des chromosomes à
deux chromatides, ce qui veux dire que l'ADN est déjà doublé. Il n'y a
donc pas de doublement de matériel génétique durant l'intercinèse




.

MÉIOSE II - PHASE ÉQUATIONELLE

La deuxième division de la méiose est une division équationelle,
c'est-à-dire que les cellules filles auront le même nombre de
chromosomes que les cellules mères. Les 4 cellules produites lors de la
méiose sont donc HAPLOIDES. La deuxième division est semblable à une
mitose alors les descriptions ne seront pas répétées ici.

Remarquez que ce dessin présente une cellule 2N = 6, donc une cellule
qui a 3 paires de chromosomes homologues. À la prophase I les
homologues vont se joindre ensemble (synapsie) pour s'échanger des
fragments de chromosomes, c'est le crossing-over ou l'enjambement. La
méiose I a comme résultat deux cellule filles ayant chacune 3
chromosomes dédoublés. Lors de la méiose II les chromatides se séparent
et le produit final de la méiose est 4 cellules filles haploides ayant 3
chromosomes (n=3). La méiose II ressemble plutôt à la méiose puisque
c'est la séparation de chromatides soeurs qui se fait (à la méiose I
c'est la séparation des chromosomes homologues qui se fait).

iII. L’ACIDE DESOXYRIBONUCLEIQUE

III.1 Les constituants chimiques de l’ADN

III.1.1 Un sucre : le 2’désoxy D Ribose ( D Ribose pour ARN )

III.1.2 Des bases azotées :

- Puriques : adénine et guanine

- Pyrimidiques : cytosine et thymine (uracil pour ARN).

III.1.3 L’acide phosphorique : H3PO4


III.2 Formules de structure

BASES AZOTEES




SUCRES


ACIDE PHOSPHORIQUE



III.3 La structure

III.3.1 La structure primaire

a) liaison sucre base = nucléoside

Liaison entre d’une part le carbone 1’ du sucre et

- L’azote 1 des bases pyrimidiques

- L’azote 9 des bases puriques




Nomenclature

1) Radical + idine pour les bases pyrimidiques : cytidine, thymidine, uridine

2) Radical + osine pour les bases puriques : guanosine, adénosine


Thymidine


Adénosine





a) Liaison nucléoside + H₃PO₄ = nucléotide

Liaison ester entre une fonction acide de l’acide phosphorique et la fonction OH du carbone 5’ du sucre.




Un nucléotide
(ou nucléoside-monophosphate) est donc un nucléoside avec un phosphate
sur le carbone C5' du pentose, on parle aussi d'ester phosphorique de
nucléosides.



Nomenclature des principaux nucléotides :

Il y a donc cinq sortes de nucléotides que l'on désigne par les lettres A, T, C et G





Exemples de nucléotides :


Désoxythymidine-5'-monophosphate = dTMP



c) Assemblage des nucléotides : formation de la chaîne polynucléotidique.

- Liaison ester entre une autre fonction acide de l’acide
phosphorique et le carbone 3’ du sucre ,lacide phosphorique engage donc
deux fonctions acides dans des liaisons dites phosphodiester.

- Une fonction acide reste libre : propriété acide de la chaîne polynucléotidique.

Exemple de séquence nucléotidique ( 3 X désoxyadénosine 5’ monophosphate): 5'AAA3'






Autre séquence






ANNEXE 1

Nous avons ainsi défini la structure primaire d'un acide nucléique
comme étant la suite de ses résidus nucléotidiques unis par des liaisons
phosphodiester 3'-5'



Dinucléotide A-C








Les chaînes monocaténaires que nous venont d'expliciter ne
correspondent cependant pas encore à la véritable structure primaire des
molécules d'ADN.

L'élucidation de la structure primaire de l'ADN par Watson et Crick
en 1953 marque, dit-on , l'avènement de la biologie moléculaire moderne,
à cette époque, on parlait de structure tout court car on ne savait pas
encore comment l'ADN s'organisait spatialement.

Cette découverte , considérée comme un des plus beaux succès de la
démarche scientifique, réconciliait de nombreuses données, dont
certaines étaient encore loin d'ëtre acceptées par tous :

1) Les règles de Chargaff. A l'époque, les relations A=T et G=C restaient inexpliquées même par Chargaff

2)On pensait que la Guanine et la Thymine étaient sous forme énolique
dans la molécule alors que c'est la forme céto qui est la plus
courante.

Guanine (cétone)






Thymine (cétone)













Association de deux chaînes polynucléotidiques.

Ces deux chaînes ont trois caractéristiques :

- Elles sont antiparallèles

- Elles sont complémentaires

- Elles sont hélicoïdales : double hélice de Crick et Watson.

a) Antiparallèles

5’ = = 3’



3’ = = 5’


b) Complémentarité

Règle de complémentarité ( Chargaff) :

A T

C G




Il résulte de cette propriété que deux chaînes de nucléotides peuvent
se lier ensemble par leurs bases azotées si leurs bases sont
complémentaires (i.e. A face à T et C face à G) ce qui est le cas dans
la molécule d'ADN.

L'ADN est donc une double chaîne de nucléotides complémentaires.


Comment expliquer cette complémentarité

Deux explications :

1° Complémentarité pour des raisons stériques, question de place,
d’encombrement. Une base purique a deux cycles tandis qu’une base
pyrimidique n’en a qu’un. Chaque paire de bases aura donc la même
dimension ce qui implique une structure régulière de la double hélice.

2° Complémentarité pour une raison de liaisons hydrogène ( formule ).

- entre A et T : 2 liaisons hydrogène

- entre G et C possibilité de 3 liaisons hydrogène.

L’édifice constitué par l’association de deux chaînes peut se diviser en deux grandes parties :

- Un squelette externe formé par l’assemblage P-S-P-S-P-S-P……..

- Une partie centrale formée par les séquences de paires de bases. Séquences caractéristiques de chaque molécule d’ADN.




Cohésion de l’association composant l’ADN

Les facteurs de cohésion de cette molécule sont :

- L’existence de liaisons hydrogène.


Une liaison hydrogène est une liaison de faible énergie entre deux atomes attirés l’un vers l’autre pour des raisons électrostatiques l’un étant riche en électrons donc nucléophile et l’autre n’ayant que les protons de son noyau donc électrophile.

• Ainsi l’atome d’hydrogène, dont l’unique électron est par nécessité dans l’orbitale qui unit cet atome au reste de la molécule, ne peut qu’être électrophile et comme tel attiré par les atomes ayant des doublets électroniques libres. • Les atomes d’azote et surtout d’oxygène possèdent respectivement deux et quatre électrons

de leur couche périphérique qui ne participent pas aux orbitales des liaisons covalentes de la molécule. Ceci leur confère un caractère nucléophile qui leur permet d’exercer une attraction sur les atomes électrophiles voisins, en particulier les atomes d’hydrogène : cette attraction

constitue une liaison hydrogène. • Lorsque les orbitales qui unissent d’un côté l’atome d’hydrogène à la molécule de gauche et de l’autre côté les doublets électroniques libres avec l’atome nucléophile sont dans le même

axe, la liaison hydrogène est plus forte.

- L’existence de liaisons hydrophobes entre plans superposés de bases.

- L’hydratation des phosphates situés vers l’extérieur de la molécule.

La structure de l’ADN ressemble à une échelle dont les montants sont
constitués par la succession P-S et les échelons par les associations de
bases azotées 2 à 2.


Lorsqu’un acide nucléique est en solution les molécules forment des
liaisons hydrogènes associant les nucléotides deux par deux, de sorte
qu’un nucléotide à adénine se lie avec un nucléotide à thymine (ou à
uracile dans un RNA) et un nucléotide à guanine avec un nucléotide à
cytosine.

• On désigne cette liaison sous le terme d’hybridation.

• L’hybridation guanine-cytosine est plus stable (3 liaisons hydrogène, -63 kJ) que celle entre adénine et thymine.






La double hélice peut se présenter sous deux formes : ADN – A et ADN – B ( forme biologique la plus importante).

Les différences au niveau de ces deux formes d’ADN se situent au niveau :

- diamètre de l’hélice

- pas de l’hélice

- orientation des paires de bases.

ADN-B

- Diamètre : 2,37 nanomètres

- Pas de l’hélice : 3, 40 nanomètres

- Distance entre paires de bases : 0,33 nanomètres.

- Paires de bases perpendiculaires à l’axe de l’hélice.

- 10 paires de bases par tour.


Structure schématique



Structure détaillée



Remarques :

- Unité de longueur de l’ADN, le kilo-bases(Kb) = 1000 paires de bases.

- Nombre de paires de bases par génome haploïde :

Virus : +/- 10.000

Bactéries : 4,6 .106

Insectes : 1 . 109

Hommes : 2,8 . 109

Chez certains autres Vertébrés : 1011

L’ADN peut être circulaire ou linéaire.

d) hélicoïdale, double hélice gauche ADN – Z

Dans les conditions physiologiques, il a été possible d’obtenir
l’ADN-Z en méthylant des séquences au niveau des cytosines (voir note)
ou en opérant au niveau de certains polyamines comme la spermine.

L’ADN – Z n’est pas l’image en miroir de l’ADN classique . Sa conformation est différente :

Squelette P – S – P en zig zag

Hélice plus svelte, plus torsadée que le B – ADN : 12 pdb/tour de
spire, le pas de l’hélice est de 4,46 nanomètres et le diamètre de 1,8
nanomètres.

Les bases sont plus exposées dans ce type d’ADN , l’ADN peut passer
de façon réversible d’une forme à l’autre. L’enseignement que l’on peut
tirer de cette constatation est que l’ADN est une structure dynamique
qui est capable de subir :

- Des déformation au sein de l’ossature de chaque chaîne

- Des mouvements plus lents au niveau des bases qui s’ouvrent et se ferment

On dit que : « l’ADN respire »

Il est évident que toutes ces modifications de structure sont perçues par les molécules interagissant avec l’ADN.

Exemples

- voir méthylation des gènes

- Certaines protéines sont capables de se lier spécifiquement avec ADN-Z mais non avec B-ADN.

- Ces ADN-Z binding protéines doivent jouer un rôle important dans la régulation de l’expression génique.

Cet ADN Z est rencontré dans un milieu naturel lorsqu'il y a une
abondance de séquences G-C. Les bases restent bien centrées à l'axe de
la double hélice et il y en a 12 par tour.








Les molécules d’acide désoxyribonucléiques sont formées de deux
chaînes dont les nucléotides ont hybridés deux à deux sur toute la
longueur.• Les deux chaînes sont antiparallèles, c’est à dire que
l’extrémité 5’ de l’une est du côté de l’extrémité3’ de l’autre.

• Pour que tous les nucléotides puissent s’hybrider ; il faut que
l’ordre dans lequel ils sont liés ensemble soit complémentaire de la
chaîne opposée.

• Les bases azotées liées par les liaisons hydrogènes sont tournées
vers l’intérieur, tandis que les riboses et les acides phosphoriques,
hydrophiles sont tournés vers l’extérieur.

• La chaleur peut dissocier les deux chaînes : c’est la fusion du
DNA. Cette fusion est réversible : les deux chaînes peuvent s’hybrider à
nouveau.












La structure secondaire du DNA est telle que les deux brins sont
enroulés l’un autour de l’autre. Chacun des deux brins est orienté
(5’→3’) dans le sens opposé à celui de l’autre brin (3’→5’). On dit
qu’ils sont antiparallèles.

• Les bases azotées sont tournées vers l’intérieur de la double
hélice de façon à ce que chacune s’hybride avec une base de l’autre brin
(A avec T, C avec G, etc..). On dit que les bases successives de chacun
des brins sont complémentaires.

• La double hélice a un « pas » de 3,4 nm c’est à dire qu’il y a environ 10 paires de nucléotides pour chaque tour d’hélice.


Une vue perspective de la double hélice montre bien comment les bases
azotées sont parallèles entre elles, leurs noyaux empilés comme des
assiettes au centre de la double hélice.

III.3.3 Structure tertiaire

Rappel : La chromatine est constituée d’ADN et de protéines.

Ces protéines vont imposer de nombreuse contraintes à la double hélice

Conséquences : réactions de l’ADN qui se traduira par l’apparition de surenroulements .

Lors de la transcrition ou de la réplication, l’hélice du DNA est
ouverte par une topoisomérase (hélicase) qui permet aux enzymes l’accès
au brin modèle.

• Le fait de séparer les bases complémentaires et les deux brins de
la double hélice sur plusieurs dizaines de nucléotides se traduit par un
resserrement des tours d’hélice de part et d’autre de la boucle ainsi
ouverte.

• Ce surenroulement nécessite l’intervention d’une topoisomérase qui
va desserrer les tours d’hélice en coupant un brin ou les deux brins du
DNA, puis en les faisant tourner l’un autour de l’autre jusqu’à revenir à
10 nucléotides par tour d’hélice.

• Des protéines de stabilisation du DNA simple brin viennent se fixer sur la partie déroulée pour protéger la molécule.










III.3.3.1 Cas des ADN circulaires

ADN viraux, mitochondriaux, des plasmides, des chloroplastes.

Deux molécules d’ADN présentant la même séquence de bases peuvent
être différentes par le nombre d’enlacement, c’à d le nombre de tours
que fait un brin autour de l’autre .

Les deux molécules porteront le nom de topoisomères.

Différents états des topoisomères

- Etat relaché : par conséquent contrainte minimum et stabilité de conformation

- Etats surenroulés : surenroulé + : plus de tours

- surenroulé - : moins de tours


Le surenroulement positif ou négatif exerce une contrainte sur la molécule qui donnera un vrillage.

L’obtention d’un ADN surenroulé nécessite un apport d’énergie, ce qui
est normal puis que l’on passe d’un état sans tension à un état sous
tension.

Les topoisomérases

Les topoisomérases sont des enzymes qui peuvent modifier le nombre d’enlacements

On en distingue les deux grands types :

Les topoisomérases I sont capables de couper transitoirement
et de resouder un seul brin d’ADN double brin. Certaines topoisomérases
de type I peuvent agir soit sur de l’ADN avec superenroulement positif
ou négatif, d’autres agissent uniquement sur l’ADN avec
superenroulement négatif.

Les topoisomérases II coupent de manière transitoire les
deux brins de l’ADN, puis les ressoudent, c’est le cas de la gyrase
bactérienne. Cette enzyme permet de désenrouler l’ADN.

Conséquences de l’action des topoisomérases

- L’ADN surenroulé est plus compact que son homologue relaché.

- Les topoisomérases favorisent la réplication, la transcription ou
encore la recombinaison avec avec d’autres segments d’ADN. En effet, de
nombreuses protéines intervenant dans ces mécanismes ne se lieront à
l’ADN que s’il est surenroulé -, c’est à dire désenroulé .

Exemple : exemple d’un antibiotique sur colibacille : ce médicament
bloque la girase, ce qui a pour conséquence d’empêcher les
surenroulements et de bloquer la réplication de ces bactéries.

III.3.3.2 Cas des ADN linéaires ( cas des Eucaryotes)

Dans ce cas, il y a problème d’encombrement . En effet, le diamètre
du noyau n’excède pas 1/100 ème de millimètre et la longueur de la
molécule d’ADN est de l’ordre de grandeur du mètre, cet ADN étant ancré à
la membrane nucléaire.

La solution à ce dilemme est la compaction de l’ADN .

Cette compaction donne naissance à la superhélice d’ADN

Il faut également assurer une certaine protextion aux brins d'ADN

Le DNA a besoin d’être protégé par des protéines lorsqu’il n’est pas
utilisé comme modèle pour l’expression des gènes ou la réplication.

• Cette protection se fait par enroulement autour de protéines
basiques (cationiques) capables de se lier avec le DNA qui est un
polyanion. Des octamères d’histones sont au centre de particules qu’on
trouve tous les 200 nucléotides et autour desquels le DNA s’enroule. La
structure évoque un « collier de perles ».

• Le DNA ainsi lié aux histones est protégé contre l’action des
enzymes. Une endonucléase peut digérer le DNA entre les « perles » et
détacher des particules de 11 nm de diamètre appelées nucléosomes.

• Chaque nucléosome est constitué d’un fragment de DNA de 145 paires de nucléotides et de huit molécules d’histones.

Etude de la super hélice d’ADN

Les protéines accompagnant l’ADN dans la chromatine font partie de deux groupes

1. Les protéines histoniques

Ce sont des protéines basiques ou Histones (HP). Ces protéines sont
stables et contiennent 20 % d’acides aminés basiques ( arginine,
lysine).

Ces acides aminés sont regroupés du coté de la terminaison amine de
la protéine , ce qui confère à cette partie un renforcement de charges
+.

Il y a donc possibilité d’établissement de liaisons ioniques avec la molécule d’ADN.

Ces histones peuvent subir des modifications covalentes réversibles.

Résultat = changements de charges de ces protéines.

Exemple : la lysine peut subir une acétylation ( charge - )

La sérine peut subir une phosphorylation ( charge - )

Les rôles physiologiques de ces protéines peuvent ainsi être modifiés.

Hypothèse récente

Il a été découvert récemment que les histones oscillaient entre des
états d'acétylation différents. Les histones acétylases dissocient la
chromatine et permettent l'activation de la transcription. Les histones
deacétylases referment la chromatine et bloquent toute activité.

Mode d'Action des Histones Acétylases

L'acétylation des histones se fait sur la partie NH2 terminale. Elle
neutralise la charge positive de la partie N terminale des histones. Des
modifications électrostatiques expliquent alors le changement de
conformation du nucléosome, les charges négatives de l'ADN étant moins
attirées par la partie Nter des histones maintenant neutre. Il est
probable que chaque histone soit modifiée de manière différente et
spécifique et que cela implique des réponses différentes, mais cet
aspect reste pour l'instant mal connu.

Facteurs de Transcription et Histone Acétylases

Une des étapes essentielle de l'activation d'un facteur de
transcription est donc son association avec une acétylase (activateur)
ou déacetylase (répresseur). Ce co-facteur va moduler l'accessibilité
des promoteurs et permettre ou non la régulation.

Importance des Histones Acetylases

La régulation par acétylation/déacetylation semble être commune a
tous les facteurs de transcription. L'association avec une histone
acétylase (ou déacetylase) constitue une étape initiale et obligatoire
de l'activation transcriptionnelle.

Les différentes histones

H1 H2A H2B H3 H4

H2A + H2B se groupent pour former un dimère

2 H3 + 2 H4 se groupent pour former un tétramère.

Le tétramère entouré de deux dimères donne un octamère de 11nm de diamètre et de 5,5 nm de hauteur.

En présence de ce bloc d’histones, l’ADN va être contraint d’ adopter
une conformation super hélicoïdale, le tout formant un nucléosome.

Le nucléosome est constitué :

- D’une bobine d’histone

- D’un tour ¾ d’une super hélice gauche soit 146 paires de nucléotides.

Deux nucléosomes sont séparés par un ADN bicaténaire d’environ 54 paires de nucléotides .

Image de la fibre de chromatine

La fibre de chromatine peut être comparée à un collier de perles


Chaque perle étant un nucléosome avec son ADN nucléosomique , entre
les nucléosomes, de l’ADN internucléosomique ( 20 paires de bases. ).








Rôle de H1

Cette histone se place à l’entrée et à la sortie de l’ADN du
nucléosome, son rôle est de provoquer un reploiement de la fibre en
solénoïde, une compaction de l’ADN






Le DNA qui entoure chaque nucléosome et le relie en « collier de
perles » aux nucléosomes suivants, forme la trame d’une structure
hélicoïdale qui enroule les colliers de perles sur euxmêmes.

On décrit aussi cette structure comme un solénoïde.• Le diamètre de
cette hélice est de 30 nm et forme une grande partie de la chromatine
dite

« compactée » où le DNA n’est pas accessible.

• Toutefois, des séquences reconnues spécifiquement par des protéines
de liaison au DNA interrompentde place en place cette structure
compacte.


2. Les protéines non histoniques (NHP)

Ce sont des protéines hétérogènes, métaboliquement instables , à
renouvellement rapide. Elles sont présentes en petites quantités et mal
connues.

Parmi elles, on trouve les GRP ( gene regulatory protein) . Ces
protéines régulatrices de gènes sont essentiellement des activateurs
chez les Eucaryotes.

Elles viennent se placer à proximité du site de l’ARN
polymérase.Elles facilitent la liaison de cette enzyme avec l’ADN et
activent de la sorte la transcription.

Voir la régulation génétique.

Conclusion : Ces protéines qui ont une affinité variable pour l’ADN
permettent de comprendre l’expression sélective de l’information
génétique.

Expression sélective de l’information :

- Variable d’un type de cellule à l’autre

- Variable en fonction des besoins physiologiques d’une même cellule.

Il convient de ne pas oublier que dans le noyau de chaque cellule d’un organisme existe un génome complet

III.4 Notions sur l’étude des séquences d’ADN

Quelles sont les différences entre deux molécules d’ADN ?

Les différences portent uniquement sur les séquences de bases.

Comment déterminer ces séquences de base ?

1. Découverte d’enzymes particulières en 1978, des endonucléases de restriction.

2. Ces enzymes sont capables de couper l’ADN en des endroits bien précis.

3. Possibilité d’analyser les fragments ainsi obtenus ( partie non développée dans ces notes).

Les enzymes de restriction

On connaît actuellement environ 200 enzymes de ce type , chacune reconnaît une séquence de nucléotides qui lui est spécifique.

Les enzymes ont été classées en 3 groupes. Les enzymes de type I et
de type III ont à la fois l'activité de modification (méthylation) et
l'activité de restriction (coupure) dépendante de l'ATP.

Les enzymes de type I et III se distinguent par la manière de couper l'ADN. Elles ne sont pas très utilisées en génie génétique.

Les enzymes de restriction de type II appartiennent à des systèmes
binaires composés d'une endonucléase de restriction qui clive une
séquence spécifique de nucléotides et d'une méthylase distincte qui
modifie la même séquence de reconnaissance.

Les enzymes de restriction coupent les deux brins d'une molécule
d'ADN au niveau de séquences de reconnaissance particulières,
typiquement 4 à 8 nucléotides avec un axe de symétrie d'ordre 2
(palindrome).

Ceci génère, pour chaque brin, deux extrémités, l'une ayant un
groupement 3'-OH, l'autre un groupement 5'-phosphate. Environ 150
enzymes de restriction ont été isolées à partir de plusieurs centaines
de souches bactériennes.

Les noms des enzymes sont des abréviations des souches bactériennes à
partir desquelles elles ont été isolées Un chiffre romain indique
l'ordre de découverte des enzymes. Les enzymes les plus utilisées au
laboratoire sont celles qui reconnaissent un site de quatre ou de six
nucléotides.

Séquences reconnues

Comme spécifié plus haut, les séquences reconnues sont nommées palindromes

( ex radar).

Exemple :


Autre exemple avec endroit de coupure, l’enzyme de restriction Hind
III qui reconnaît la séquence spécifique (et palindromique) suivante:






Le palindrome reconnu a de 4 à 8 paires de bases.

Origine de ces enzymes

C’est une origine bactérienne. Chez la bactérie, ces endonucléases
auraient pour rôle de déparasiter, d’enlever les séquences de bases
virales.

Les enzymes de restriction agiraient comme de véritables sécateurs.

Caractéristiques des coupures

Deux types de coupures possibles :

1. Coupures franches : c’a d coupure au milieu du palindrome.

Exemple :




2. Coupures en bouts collants :

Exemple








Remarques

1. L’enzyme de restriction coupera chaque fois qu’elle rencontrera son palindrome spécifique.

2. N’y a-t-il pas un danger pour la bactérie que ses enzymes ne
coupent son propre ADN ? Car sur son ADN se trouvent aussi des
palindromes.

Pour éviter ce désagrément , la bactérie va modifier ses propres
palindromes : ce qui est réalisé par des enzymes appelées méthylases de
modification ou enzymes de méthylation.

L’ADN bactérien présente des sites de restriction susceptibles d’être
repérés par les enzymes de restriction que possèdent la bactérie.

Pour éviter une auto-destruction, les enzymes de modification de l’ADN bactérien interviennent.

La méthylation de la cytosine (sur le carbone 5) ou de l’adénine (sur
l’azote 6) appartenant à des sites de restriction aboutit à une
inactivation de l’enzyme de restriction correspondante.

Cette méthylation peut se réaliser sur une base ou sur plusieurs
bases appartenant au site de restriction. Les méthylases bactériennes
sont très spécifiques. Prenons l’exemple de l’enzyme de restriction Hind
III qui reconnaît la séquence spécifique (et palindromique) suivante:

La méthylation de l’adénine (représentée sur le schéma associée avec
un cercle) aboutit à une absence de reconnaissance de ce site spécifique
par l’enzyme Hind III et donc à une absence de coupure enzymatique:

5’-Å-A-G-C-T-T-3’

IV REPLICATION DE L'ADN

Lors de la division cellulaire, quand une cellule-mère donne deux
cellules-filles, il est essentiel que l’ADN présent dans les
cellules-filles soit la copie identique de l’ADN présent dans la
cellule-mère. Cette copie de l’ADN est indispensable à réaliser avant la
mitose (ou division cellulaire) on parle de réplication de l’ADN.
Préalablement à toute division cellulaire, la quantité d’ADN est
multipliée par deux. Les mécanismes de réplication conditionnent donc le
déroulement de la division cellulaire.


La croissance des brins d’acides nucléiques se fait toujours par leur extrémité 3’-OH terminale.

• La condensation se fait à partir d’un substrat « activé » : un des
nucléosides triphosphates. La rupture d’une liaison riche en énergie
fournira l’énergie nécessaire à la condensation. Le nucléoside
monophosphate restant sera estérifié par une fonction acide de son
phosphate sur la fonction alcool libre du carbone 3’ du ribose qui
constitue l’extrémité de l’acide nucléique.

• Inversement, en ajoutant une molécule d’eau sur cette liaison
ester, on provoquera une réaction d’hydrolyse qui détachera le dernier
nucléotide et libérera le carbone 3’ du nucléotide précédent.


L’hybridation des nucléotides complémentaires peut se faire sur toute
la longueur d’un brin d’acide nucléique : par des liaisons hydrogène,
on associe systématiquement les C avec des G et les G avec des C, les A
avec des T et les T avec des A.

• En réunissant tous les nucléotides ainsi associés par des liaisons
phosphodiester on constitue une séquence complémentaire de la séquence
originale. Ces deux séquences sont obligatoirement orientées dans des
sens opposés : on dit qu’elle sont antiparallèles.

• De cette façon, grâce à des enzymes spécifiques, une séquence
d’acide nucléique dite « originale » est capable de diriger la synthèse
d’une séquence d’acide nucléique complémentaire.

• Dans un second temps, cette séquence complémentaire isolée, sera
elle aussi capable de diriger la synthèse de la séquence originale dont
elle est le complément.



IV.5.1 La réplication chez les procaryotes

IV.5.1.1 Caractéristiques fondamentales

- La réplication de l’ADN est semi-conservative (Meselson et Stahl, 1958).

A chaque réplication, les deux brins d’ADN parental se séparent,
chacun de ces deux brins sert de matrice pour la synthèse d’un brin
complémentaire.

Chaque molécule de l’ADN fille portera un brin de l’ADN mère.

IV.5.1.2 Eléments nécessaires pour la réplication.

La réplication de l’ADN nécessite:

- Tout d’abord, une matrice d’ADN constituée par un brin parental.

- La présence de nucléotides propres à l’ADN, c’est-à-dire contenant
du 2’-désoxyribose, des bases A, T, G et C et sous forme de nucléosides
triphosphates porteurs d’énergie pour les réactions d’assemblage: dATP,
dTTP, dCTP et dGTP (on écrit souvent pour les dénommer dNTP).

- La présence de nombreux enzymes pour assurer la séparation des deux brins et accrocher les nucléotides les uns aux autres

- La présence de certains ions (cations bivalents: Mg2+, ce cation est indispensable pour la réplication de l’ADN).

IV.5.1.3 Mécanisme de la réplication

1. Caractéristiques fondamentales de la réplication

La réplication se fait :

- dans le sens 5’ 3’

- de façon complémentaire

- de manière antiparallèle.

2. Ouverture de la double chaîne

L’enzyme responsable de l’ouverture de la double chaîne est appelée
hélicase, après une certaine ouverture, celle-ci est bloquée , par
l’existence de contraintes.

Une première étape pour la réplication du DNA est constituée par ces changements de forme topologique.

Ces contraintes peuvent être supprimées par des enzymes

- Girase qui crée des supertours négatifs ( Topoisomérase II)

- Topoisomérase I.

Le DNA d’un chromosome qui peut mesurer jusqu'à 1 m déroulé en
totalité, change sa forme super enroulée pour passer à une forme moins
enroulée, dans laquelle il est accessible aux autres enzymes .

Deux types de topoisomérases

• la topoisomérase de type I coupe l'un des deux brins du DNA, le DNA
peut se dérouler en une forme B, puis survient une nouvelle ligature du
DNA.




• la topoisomérase de type II agit en coupant les deux brins du DNA
(extrémité 3’ du DNA), et joue un rôle dans le relâchement des boucles
pour la transcription semi réplicative.


C’est James
Wang qui dans les années 70 découvrit une nouvelle classe d’enzyme, les
topoisomérases, qui sont capables de changer la topologie de la molécule
d’ADN en effectuant une coupure temporaire dans la molécule pour y
faire passer soit un brin, soit les deux brins de la double hélice. Ce
faisant, ces enzymes permettent de relâcher les contraintes de torsion
sur une molécule ou de désenchevêtrer deux molécules entortillées.





Après l’action des topoisomérases et girases, des hélicases séparent les deux brins de DNA.

Puis, des polymérases sont actives, commençant la synthèse par un
brin du DNA (du côté 3' : brin direct), complétant ensuite sur le brin
retardé (voir point suivant), à travers une RNA primase.

Chez l'homme, toutes les enzymes impliquées ne sont pas totalement
connues : on distingue des polymérases a , b , g , d et e n'ayant pas
toutes les propriétés des polymérases des procaryotes chez qui l’on
distingue les polymérases I, II et III.

Des protéines accessoires de la réplication existent chez l'homme :
le PCNA (proliferating Cell Nuclear Antigen) est le premier décrit. Il
s'agit d'un puissant activateur de la polymérase d , stimulé lors de la
division cellulaire. Le PCNA semble avoir aussi un rôle dans la
réparation des anomalies du DNA (cf. plus bas).

Certains antibiotiques inhibent l’action de ces enzymes. Chez les bactéries, arrêt de réplication signifie mort.

Les brins séparés de l’ADN sont stabilisés sous forme simple brin
grâce à la fixation de protéines appelées SSB (pour « single strand
binding »). Ces protéines SSB empêchent les deux brins d’ADN de se
réapparier.

A partir du point d’initiation se formera un œil de réplication qui
va s’agrandir jusqu’à la fin de la réplication et la séparation des deux
ADN bicaténaires.


Agrandissement de l’oeil de réplication , progression de la réplication

4. Réplication discontinue

Lors de la division cellulaire, les deux chaînes de DNA sont séparées
à une extrémité. La lecture du code génétique se fait, chez les
Procaryotes, par l’ADN polymérase III de l'extrémité 3' vers l'extrémité
5' ( brin matrice), par appariement des bases selon la loi de Watson et
Crick. La molécule fille croît donc de l'extrémité 5' vers l'extrémité
3' .

La synthèse de DNA est semi discontinue, et nécessite un segment
d’initiation à base de RNA ou. Un des brins du DNA, celui ayant
l’extrémité 5’ constitue le brin leader : sa copie se fait directement
par l’intermédiaire de la DNA polymérase III. L’autre brin nécessite la
synthèse de petits fragments (fragments de Okazaki .Les fragments
d'Okazaki ont entre 100 et 200 nucléotides de long chez les eucaryotes
et entre 1000 et 2000 chez les procaryotes), en sens inverse du brin
leader (de 5’ vers 3’) grâce à la même DNA polymérase III. Ces fragments
sont ensuite rassemblés par une DNA polymérase I et par une DNA ligase.




Schéma de la fourche de réplication.

En [1], l’hélicase sépare les deux brins du DNA.

En [2], les protéines de liaison empêchent les deux brins de se recoller.

En [3], les polymérases synthétisent les nouveaux bras de 5’ en 3’.

En [4], le brin direct est retranscrit directement.

En [5], le brin retardé est synthétisé sous forme d’éléments d’Okazaki, qui sont reliés entre eux grâce à une ligase.

5. Initiation de la réplication.

Que la réplication soit continue ou discontinue, l’ADN polymérase III
ne discerne pas les sites ou elle doit commencer son élongation, elle
ne peut qu’ajouter un nucléotide à une extrémité 3’ OH.

En fait, c’est une ARN polymérase primase qui initie la réplication
en produisant une amorce d’ARN à partir de laquelle pourra travailler
l’ADN polymérase III.Cette primase fait partie d’un complexe volumineux
parfois appelé « Primosome » ( primase + 16 polypeptides) L’amorce
formée comporte quelques dizaines de ribonucléotides.






6. Hydrolyse et remplacement des fragments d’ADN

Les amorces seront détruites et remplacées par de l’ADN.

Ce travail est effectué par une ADN polymérase I qui a deux propriétés :

1. Propriété exonucléasique qui sert à hydrolyser les amorces

2. Propriétés polymérasiques qui lui permet de remplacer amorces par de l’ADN.

7. Soudure des morceaux d’ADN.

Les fragments d’ADN seront finalement reliés par une ligase.

8. La fonction d’édition

L’enzyme ADN polymérase III a deux propriétés :

- Propriété exonucléasique 3’ 5’

- Propriété polymérasique bien sûr

La fonction d’édition est à mettre en relation avec cette première
propriété permettant de « relire » le dernier nucléotide mis en place.

Cette fonction consiste à retirer un nucléotide mal apparié et à le
remplacer par le nucléotide approprié ( fonction d’excision –
réparation.).

9. Mécanisme présidant au choix du nucléotide correct

La sélection des nucléotides résulte d’un équilibre entre plusieurs
réactions en compétition ; il est possible de placer n’importe quelle
base en face d’une autre, mais du point de vue énergétique,
l’appariement correct est le plus favorable.

La stabilité du complexe « ADN polymérase – matrice ADN – nucléotide
triphosphate est maximum lorsque ce nucléotide triphosphate est
complémentaire du nucléotide de la matrice .

Voilà la raison pour laquelle l’ADN polymérase ne peut commencer une
chaîne d’ADN ,elle doit toujours pouvoir relire le dernier nucléotide
mis en place.

Grâce à ce mécanisme haute fidélité de la réplication . L’ADN
nouvellement synthétisé comporte environ un nucléotide non
complémentaire sur 100.000.

Un autre système enzymatique par exonucléases , permettrait encore de diminuer ce pourcentage d’erreur.

Notons l’importance de l’erreur de réplication vue sous l’angle des mutations.

Les mutations sont un des moteurs de l’évolution.

Rem : succession des enzymes pour le brin retardé :

1) primase + hélicase ( primosome) , 2) topoisimérase I et II , 3) ADN polymérase III

‘4) ADN polymérase I, 5) ligase





II.5.2 La réplication chez les Eucaryotes

Le mécanisme de réplication est identique :

- Réplication bidirectionnelle.

- Réplication complémentaire, antiparalléle.

- Discontinuités pour un brin.

- Zones amorces

Différence : L’ADN est plus long que chez les Procaryotes il y a donc
plusieurs points d’initiation. Notons également que la réplication doit
s’accompagner simultanément de la synthèse d’histones pour un brin sur
deux

La réplication se fait en de nombreux points d’initiation. Elle fait
intervenir un nombre d’ADN polymérases plus important que chez les
procaryotes. De nombreuses protéines interviennent comme facteurs de
réplication.

On connaît mal les changements subis par les nucléosomes au cours de la réplication de l’ADN eucaryote.

On connait au moins 5 ADN polymérases chez les eucaryotes.

- La polymérase alpha/primase. Cette polymérase est impliqué dans
l'initiation de la réplication (tétramère protéique PM
180.000,55000,75000, 50000).

- La polymérase béta.

- La polymérase gamma. Cette polymérase est à localisation mitochondriale, bien que codée par un gène du noyau cellulaire.

- La polymérase delta.

- La polymérase epsilon.

La polymérase alpha/primase synthétise les amorces d'ARN. Une
protéine appelée PCNA ("proliferating cell nuclear antigen") intervient.

L'ADN simple brin au cours de la réplication est stabilisé par des protéines correspondant aux protéines SSB du colibacille.

Les amorces d'ARN sont détruites par la RNase H. Les lacunes formées sont comblées par les polymérases béta ou alpha.

Chez les Eucaryotes, il semble que l’origine de la réplication est
située aux points d’ancrage de la chromatine aux protéines du
cytosquelette nucléaire

V. LE COURANT D’INFORMATION CELLULAIRE

V.1 Principe

- Dans le noyau : notamment composé d’ADN comportant un nombre très
élevé de séquences. L’ADN est , en quelque sorte » une phrase écrite
avec un alphabet de quatre lettres.

- Dans le cytoplasme : Présence de protéines édifiées avec 20 acides
aminés différents. Beaucoup de ces protéines ont un rôle fonctionnel. On
peut de manière similaire à l’ADN, considérer les protéines comme des
phrases écrites avec un alphabet de 20 lettres.

On sait actuellement que la structure primaire des protéines se trouve sous forme codée dans la molécule d’ADN.

Conclusion : de manière imagée, on peut dire que : A un mot protéine
correspond un mot ADN. Ce mot ADN , c’est le gène composé d’une somme de
paires de nucléotides.

Mécanisme de transfert de l’information

ADN_____1______ ARNm_____2______ Protéine.

1)= LA TRANSCRIPTION

2)= LA TRADUCTION

*Remarque : les ARN de
transfert contiennent des bases dites "rares" telles que pseudouridine,
dihydrouridine, inosine ... qui sont en fait des bases modifiées après
la transcription. Ces bases contribuent largement à l'établissement de
la structure tridimensionnelle par des liaisons hydrogène inhabituelles.

V.2 Les acides ribonucléiques ou ARN

V.2.1 Les caractéristiques

Au point de vue squelette carboné, les acides ribonucléiques sont très semblables aux acides désoxyribonucléiques.

- Le sucre : le ribose

- Les bases azotées : Adénine, guanine, cytosine, Uracil ( Thymine déméthylée).

- H3PO4

- Une seule chaîne, plus courte, de nucléotides.

La différence entre Ribose et désoxy Ribose se situe au niveau du carbone 2’ , elle consiste en une désoxygénation du Ribose.

Ce site n’intervenant pas dans les liaisons des acides nucléiques on a
comme pour l’ADN deux liaisons phosphoriques en 3’ et en 5’




V.2.2 Les règles d’appariement

Identiques à celles gérant la structure de l’ADN bicaténaire

Deux modalités d’appariement

- Au sein d’un même brin, entre les replis en épingle à cheveux ( self complémentarité).

- Parfois entre deux brins d’ARN différents.


Le RNA diffère du DNA par plusieurs caractères :

1. il est plus court (70 à 10 000 nucléotides)

2. le squelette de pentoses et de phosphates contient du ribose à la place du désoxyribose

3. parmi les bases azotées l’uracile (U) remplace la thymine (T)

4. Les RNA sont simple brin mais certaines régions sont appariées sur
une courte distance par leurs bases complémentaires selon un ajustement
au hasard (épingles à cheveux). A apparié avec U (deux liaisons
hydrogène) et C apparié avec G (trois liaisons hydrogène). Dès lors, au
niveau des appariements, on aura la constitution de sortes de tiges
alors dans les régions non appariées, des boucles apparaîtront.

V.2.3 Les différents types d’ARN

Les cellules contiennent essentiellement quatre types d’ARN:

- Les ARN ribosomiques (ou rARN) 82%.

- Les ARN de transfert (ou tARN) 16%.

- Les ARN messagers (ou mARN) 15%.

- Les ARN nucléaires de petite taille (ou snRNA)(ou small nuclear
RNA)(snRNA) et les ARN cytoplasmiques de petite taille (ou scRNA) (ou
small cytoplasmic RNA).

ALA synthétase).

• Enfin les mRNA sont les produits de la transcription des gènes, grâce auxquels les ribosomes

reçoivent l’information nécessaire à la synthèse des protéines.




Il existe de nombreuses molécules
d’acides ribonucléiques dans presque tous les compartiments de la
cellule et ayant des fonctions variées.

• Certains (rRNA) font partie de la structure des ribonucléoprotéines du ribosome, particule responsable de la synthèse des protéines.

• D’autres sont des coenzymes transporteurs d’acides aminés pour la synthèse des protéines, ce sont les tRNA.

• Certains, beaucoup plus rares,
participent à la structure de ribonucléoprotéines diverses, responsable
de l’excision-épissage des transcrits, de la sélection des polyribosomes
liés pour l’adressage des protéines ou encore d’autres activités
enzymatiques du métabolisme (ex. : Δ-Ala synthétase )

Enfin les mRNA sont les produits de
la transcription des gènes, grâce auxquels les ribosomes reçoivent
l’information nécessaire à la synthèse des protéines.

V.2.3.1. L’ARN ribosomial ( ribosomique ).

- Les rARN des procaryotes (E. coli).

Les ribosomes dits 70 S (S = unité de sédimentation ou Svedberg) sont formés de deux sous-unités

Chaque sous-unité comporte des protéines dites protéines ribosomales (ou r-protéines) et des rARN :

Sous unité 50S

La sous-unité 50 S

Contient deux rARN dits 5 S et 23 S et également un nombre considérable de protéines (au moins 31 !),

la sous-unité 30 S

Ne contient qu’un rARN dit 16 S avec au moins 21 protéines.




- Les rARN des eucaryotes.

Chez les eucaryotes, les ribosomes sont plus gros (80 S) avec également une structure à deux sous-unités (40 S et 60 S).

Sous unité 60 S

La sous-unité 60 S contient trois rARN différents (5 S, 5,8 S et 28 S) et 45 protéines.

Sous unité 40 S

La petite sous-unité 40 S ne contient qu’un seul rARN 18 S) et 33 protéines.

Notons en remarques :

- que les différences de taille et de composition quantitative en
protéines et ribonucléotides ribosomiaux a des implications importantes :

En effet, certains antibiotiques agissant au niveau des ribosomes
auront un action spécifique au niveau des ribosomes bactériens sans
léser les ribosomes de l’eucaryote parasité.

- La synthèse des ribosomes par la cellule est une opération onéreuse
: 55 ou 78 protéines à synthétiser demande beaucoup d’énergie, la
cellule ajustera donc constamment la synthèse à ses besoins.

V.2.3.1.1 Rôle de ces ARN

- Structure du ribosome

- Faciliter la fixation des autres ARN sur le ribosome .

V.2.3.2 L’ARN de transfert

V.2.3.2.1.Structure des tARN.

Les tARN présentent bien entendu la structure générale des ARN. Mais ils possèdent en plus quelques particularités propres.

- Des bases inhabituelles.

Tout d’abord, ils contiennent des nucléotides inhabituels par les
bases qu’ils renferment. Ainsi, l’hypoxanthine, dont le nucléotide
correspondant est l’IMP (I = inosine monophosphate), mais aussi la
thymine ou des bases méthylées. Ces bases ne sont pas incorporées telles
quelles au moment de la synthèse de l’ARNt, elles sont formées
ultérieurement par modification des 4 bases A U G C.

- La structure spatiale des tARN.


Les chaînes de tARN sont constituées d’une centaine environ de
nucléotides. Surtout, il existe des zones d’appariement selon la règle
de complémentarité et des zones appelées boucles sans appariement où
sont présentes les bases inhabituelles. La forme générale est celle d’un
L. En structure spatiale, on présente souvent les tARN sous forme de
trèfle.


V.2.3.2.2 Rôles de ces ARN

Les tARN sont les vecteurs qui vont transférer les acides aminés jusqu’à l’usine ribosome où s’effectue la synthèse protéique.

V.2.3.2.3 Liaison ARNt et acide aminé

Type de liaison : liaison ester ( liaison covalente )

aa-COOH 3’OH : A-C-C ARNt ------------> aa-COOARNt +H₂O

Cette réaction se réalise en présence d’une enzyme : l’amino acyl
ARNt synthétase et requiert un apport d’énergie sous forme d’ATP ( deux
liaisons riches en énergie).

Mécanisme

1. Activation de l’acide aminé : aminoacyl-AMP

aa-COOH + HO(ATP)------------->aa-COOAMP + PPi devenant 2Pi

= Fonction anhydride, ( liaison riche en énergie).

2. Transfert de l’acide aminé sur ARNt : aminoacyl-ARNt

aa-COO-AMP + HO(ARNt)------------> aa-COO-ARNt + AMP.

= Liaison ester

Bilan final

aa + ARNt + ATP----------->aa-ARNt + AMP + 2 Pi

V.2.3.2.4 Remarques

1. La liaison ester aa-ARNt est riche en énergie.

C’est assez particulier sur le plan énergétique, car habituellement,
la liaison ester n’est pas riche en énergie. Notons que l’énergie libre
standart d’hydrolyse de aminoacyl – ARNt est a peu près égale à celle
d’une liaison phosphoanhydride de l’ATP. L’énergie contenue dans la
liaison aa-AMP est partiellement transmise à la liaison aa-ARNt . La
transformation de aa-AMP en aa-ARNt est d’ailleurs liée à l’hydrolyse
subséquente de PP, donnant 2PPi libérant de l’énergie.

Donc : les ARNt apportent aux ribosomes :

- les acides aminés

- l’énergie nécessaire pour les accrocher les uns aux autres au moment de la synthèse protéique ( liaison peptidique.).

2. L’aminoacyl synthétase est une enzyme très spécifique , elle reconnaît le bon ARNt et le bon acide aminé correspondant.






La formation des aa-ARNt est une étape très importante, pas d’erreur à ce niveau.

Mais : L’enzyme reconnaît facilement les différents ARNt ( structure
tertiaire différente mais reconnaît parfois plus difficilement l’acide
aminé.

Exemple : confusion Valine Isoleucine

Val-AMP ARNt de Ile ?

L’isoleucine-ARNt synthétase va hydrolyser ce Val-AMP .

De tels enzymes ont des fonctions d’édition, elles sont capables de corriger les épreuves.

Remarques

- C’est l’ARNt qui par son anticodon détermine quel acide aminé doit être incorporé dans la chaîne peptidique.

- Un type d’ARNt donné transporte toujours le même d’acide aminé.

- Un même acide aminé peut être transporté par plusieurs ARNt spécifiques.

V.2.3.2 L’ARN messager.

- Les ARN messagers (ou mARN) constituent le support essentiel de
l’information génétique entre l’ADN et le ribosome où s’effectuera la
synthèse protéique.

- Leur durée de vie est très courte à la différence des tARN par
exemple. Chez les bactéries, la durée de vie d’un mARN est de quelques
minutes environ. Les mARN sont très rapidement synthétisés et dégradés.

- Ils sont formés d’une seule chaîne de nucléotides avec les bases
communes aux ARN: A, U, C et G. Cette chaîne comporte une succession de
triplets nucléotidiques. Chaque triplet nucléotidique constitue un codon
spécifique d’un acide aminé donné. Nous étudierons en détail dans la
biosynthèse protéique les mécanismes de reconnaissance codon-anti-codon.

V.2.3.3 Les petits ARN nucléaires

Les petits ARN nucléaires (ou snRNA) sont présents dans le noyau des
cellules et sont impliqués dans certaines étapes de la transcription,
c’est-à-dire la copie de l’ADN en ARN messager. Ces snRNA sont présents
sous forme de particules ribonucléoprotéiques qui sont appelées snRNP :
small nuclear ribonucleoparticles ou snurps. Dans le cytoplasme, on peut
retrouver des petits ARN (ou scRNA, c=cytoplasmic) qui existent
également sous forme de particules ribonucléoprotéiques (appelées scRNP :
small cytoplasmic ribonucleoprotein particles ou scyrp).

Remarque :

Des ARN peuvent former des appariements comme dans la molécule d'ADN
et constituer des ARN doubles brins ou bicaténaires. Les appariements se
font selon la règle de complémentarité A : U et C : G.

RAPPELS




La double hélice





















L’acide désoxyribonucléique (ADN ou DNA) est constitué de deux
chaînes de nucléosides monophosphates liés chacun par une liaison ester
entre son carbone 3’ (alcool secondaire) et le carbone 5’ (alcool
primaire) du nucléotide suivant.

• Ces deux chaînes de nucléotides sont unies entre elles par des
liaisons hydrogènes pour former un hybride en forme de double hélice
(modèle de J.D. Watson et F.H.C. Crick, 1953) dont les



deux brins sont :

— antiparallèles : l’un est constitué d’un enchaînement commençant à
gauche et se poursuivant vers la droite, l’autre commençant à droite et
se poursuivant vers la gauche ;

— complémentaires : chaque adénine (A) d’un des deux brins est liée
par deux liaisons hydrogène avec une thymine (T) de l’autre brin, et
chaque guanine (G) d’un brin est liée par trois liaisons hydrogène avec
une cytosine (C) de l’autre brin.

• De sorte que si on désigne les nucléotides par les lettres A, C, G
et T en fonction des bases azotées qu’ils contiennent, on peut lire sur
cette figure le texte suivant :

...AGAGTCGTCTCGAGTCA...



...TCTCAGCAGAGCTCAGT...



Séquence d'un gène Apo A- II

Ecrire à la suite les lettres A, C, G et T dans l’ordre où on
rencontre les nucléotides sur l’un des brins du DNA de l’extrémité 5’ à
l’extrémité 3’ aboutit à un texte indéchiffrable (voir l’image).

• Pourtant sur cette diapositive le texte ainsi transcrit contient
toute l’information nécessaire pour la synthèse d’une protéine
(l’apolipoprotéine A-II). C’est pourquoi on appelle ce brin de DNA le
brin « sens ». L’autre brin est le brin complémentaire ou brin «
antisens ».

• L’ensemble de l’information génétique transmise par chacun des
parents à un enfant (génome haploïde) peut s’écrire ainsi en 3 milliards
de lettres (une bibliothèque de 7000 livres de 300 pages chacun !)

• Les protéines du noyau savent chercher sur les brins de la double
hélice du DNA des suites de lettres (séquences) sur lesquelles elles se
fixent spécifiquement. Les effets de cette fixationde protéines sur le
DNA vont permettre l’expression de l’information contenue dans le DNA
pour faire vivre un individu.

















Pour permettre la biosynthèse d’une protéine, il doit y avoir dans la
structure du DNA d’un sujet, une séquence de nucléotides qui constitue
le gène de cette protéine.



• Dans la séquence du gène on distingue des séquences en amont
(éléments régulateurs, promoteur),un site d’initiation de la
transcription, une suite variable d’exons et d’introns : exons
non-traduits ou traduits, introns comportant éventuellement d’autres
séquences régulatrices,et enfin la fin de la transcription à la fin du
dernier exon.

• L’ensemble des mécanismes qui à partir de la séquence du gène
conduisent à la productiond’un acide ribonucléique ou d’une protéine est
désigné sous le terme d’expression de ce gène.











L’expression d’un gène est une suite de synthèses chimiques et de
réactions aboutissant à la production d’un acide ribonucléique ou d’une
protéine.



• Dans un premier temps a lieu la synthèse d’un acide ribonucléique,
dont la séquence est complémentaire d’un des deux brins du gène donc
identique à celle de l’autre brin : c’est la transcription.

• La séquence de l’acide ribonucléique est identique à celle du brin
sens et orientée dans lemême sens. Elle se construit de 5’ vers 3’ en
complémentarité de celle qui est « lue » sur le brin antisens.

• Après des réactions de maturation le transcrit primaire (RNA) devient RNA messager (mRNA)et sort du noyau vers le cytoplasme.

• Dans le second temps, le RNA messager est « lu » par groupe de
trois nucléotides (lettres) grâce à un RNA complémentaire qui porte
l’acide aminé correspondant.

• La « lecture » du mRNA se fait de 5’ vers 3’ et la synthèse de la
protéine se fait en même temps de l’extrémité NH2 terminale vers
l’extrémité COOH terminale.

• Après des réactions de maturation, la protéine « mature » est prête à remplir sa fonction dans la cellule.

VI.LA TRANSCRIPTION .

VI.1Définition

Il s’agit d’un mécanisme de synthèse d’ARN à partir d’un fragment
d’ADN appelé gène. Dans cette procédure, un seul brin du fragment d’ADN
concerné est copié.

ou




VI.2 Caractéristiques de la transcription

La synthèse s’opère dans le sens 5’ 3’, de façon antiparallèle et complémentaire .

VI.3 Eléments nécessaires à la transcription

La transcription nécessite :

- Des ribonucléotides activés : ATP , GTP , CTP , UTP.

- Une enzyme : l’ARN polymérase, qui catalysera la formation de la
chaîne polynucléotidique. Les sels de Magnésium sont indispensables au
fonctionnement de cette enzyme.

La transcription fait donc intervenir une activité enzymatique nommée
ARN polymérase holoenzyme. Cet énorme complexe enzymatique déroule et
disjoint les deux brins de l'ADN hélicoïdale. Il recrute les
mononucléotides du futur brin d'ARN et les assemble par complémentarité
avec les bases de la séquence du brin d'ADN.

- Un modèle d’ADN.

VI.4 Différentes étapes de la transcription

La transcription porte sur un gène bien défini , donc elle est sélective.

Comment les séquences à traduire sont-elles reconnue par l’ARN ase ?

1ère étape : début de la transcription ( initiation).

On donne par convention, le chiffre +1 au premier nucléotide à partir
duquel la transcription commence. Le chiffre -1 désigne le nucléotide
qui le précède.

Le signal pour initier une transcription correcte est appelé
promoteur. Cette séquence d’ADN est située juste avant le début de la
région où commencera la transcription.

Les promoteurs les plus simples sont les promoteurs des gènes des
procaryotes. Nous étudierons pour commencer essentiellement ceux-ci, les
promoteurs des gènes des eucaryotes étant beaucoup plus complexes.

Chez les procaryotes.

Les promoteurs sont pour la plupart situés en 5’ (ou en amont) du
site +1 d’initiation de la transcription et sont constitués de plus ou
moins 40 paires de nucléotides. Ces promoteurs ne sont donc pas
transcrits.

La comparaison des séquences des promoteurs de nombreux gènes de
procaryotes (E. coli) a montré la présence de séquences nucléotidiques
courtes présentant une grande similitude de structure. Deux séquences
nucléotidiques sont remarquables.

- Une séquence située entre -30 et -35 paires de bases environ en
amont de l’origine de la transcription est appelée séquence -35. Cette
séquence -35 présente un motif de six bases bien conservées: TTGACA.

- Enfin, à environ 10 nucléotides en amont de l’origine de la
transcription, on retrouve un motif TATAAT. Cette séquence dite séquence
-10 est appelée également boîte de PRIBNOW.

La distance séparant les sites -35 et -10 est comprise entre 16 et 18
pb dans 90% des promoteurs des procaryotes. Le maintien d'une telle
distance est d'importance pour la fixation de l'ARN polymérase.










Chez les procaryotes, les ARN présents: ARN messagers, ARN de
transfert et ARN ribosomaux sont synthétisés par la même ARN-polymérase.
L’ARN-polymérase d’E. coli est composée de 5 sous-unités qui sont des
chaînes polypeptidiques distinctes, 2 chaînes alpha, 1 chaîne béta, 1
chaîne béta’ et 1 chaîne s (sigma). L’ensemble de ces cinq sous-unités
constitue l’holoenzyme de l’ARN-polymérase. La sous-unité sigma n’est
pas associée en permanence à ce complexe mais de manière transitoire. Sa
présence est nécessaire pour permettre à l’ARN-polymérase de
reconnaître les sites promoteurs. Après l’initiation, cette sous-unité
sigma se dissocie. Le noyau de l’enzyme (« core ») est constitué par les
sous-unités (alpha)2bétabéta’ et il contient le site catalytique de
l’enzyme responsable de l’élongation de la chaîne polynucléotidique.








Le complexe formé par le noyau de l’enzyme et le facteur s vient se
positionner sur le promoteur. Il recouvre une région située entre les
positions -60 et +20. Dès lors, placée sur cette région, l’ARN
polymérase protège l’ADN de l’action de désoxynucléases. Cet effet de
protection a été démontré par des expériences de "foot-printing". Une
dénaturation locale de l’ADN se fait de la position -10 à la position
+1. Dès la formation de la première liaison phosphodiester du mARN, le
facteur s est relâché. Des facteurs additionnels protéiques et le degré
d’enroulement de l’ADN influent sur l’activité transcriptionnelle. Il
est évident que la transcription a un effet très important sur la
structure locale de l'ADN. Dès lors, l'action des enzymes suivantes :
gyrase (qui introduit des super-tours négatifs) et topoisomérase I (qui
enlève des super-tours négatifs) est essentielle en avant et en arrière
de l'ARN polymérase au cours de sa progression le long de l'ADN.






Chez les Eucaryotes

1) Initiation

On connaît moins bien les signaux de début de transcription.

Contrairement aux procaryotes qui possèdent qu’une seule ARN
polymérase, les eucaryotes ont trois ARN polymérases qui assurent la
synthèse des différents ARN. La transcription implique donc:

1. L’ARN polymérase I. Elle transcrit les rARN: 5,8 S, 18 S et 28 S, sauf le rARN 5 S.

2. L’ARN polymérase II. Elle transcrit les précurseurs des mARN ou transcrits

3. L’ARN polymérase III. Elle transcrit les tARN, les rARN 5 S et une faible fraction des ARN nucléaires.

Ces trois ARN polymérases ont été initialement distinguées par leur
sensibilité à un poison isolé des champignons (amanites phalloïdes):
l’a-amanitine. Des trois ARN polymérases, l’ARN polymérase II est la
seule très sensible à ce poison. Ces ARN polymérases sont localisées
dans le noyau de la cellule.

La transcription par chacune des ces trois ARN-polymérases implique
les trois même phases que chez les Procaryotes à savoir initiation ,
élongation, terminaison.

Les ARN ase III reconnaîtrait :

- Vers la séquence –30 une TATA box ( équivalent de la PRIBNOW box)

- Vers la séquence –130, une CAAT box

Si on provoque une mutation au niveau de la TATA box : 50 à 70% d’inhibition de la transcription.

La transcription par chacune des ces trois ARN-polymérases implique les trois étapes suivantes:

Toutes les ARN polymérases ont besoin de facteurs multiples pour se
positionner au point de départ de la transcription. Il existe des
facteurs généraux de la transcription qui contribuent à un niveau bas de
transcription. Des facteurs additionnels par exemple activateurs
peuvent augmenter la transcription au-delà du niveau basal.

En détail

L’expression du génome aboutit à la synthèse dans les cellules de
macromolécules acides nucléiques et protéines, dont la structure
primaire est déterminée par celle du DNA.

• Cette expression se fait par deux mécanismes principaux :

— la structure primaire du DNA s’exprime d’abord par la synthèse
d’acides ribonucléiques dont la structure primaire est parallèle à celle
du DNA. C’est la transcription.

— la structure transcrite sur certains RNA, dits « messagers »,
s’exprime enfin par la synthèse de protéines dont la structure primaire
traduit en acides aminés l’information portée par la structure primaire
du DNA. C’est la traduction.

• La transcription est conduite par plusieurs enzymes :

— RNA-polymérase I qui synthétise les RNA cytoplasmiques : RNA ribosomiques (18 S-5,8 S- 28 S)

— RNA-polymérase II qui synthétise les RNA messagers qui contiennent
l’information destinée à la traduction et certains des snRNA

— RNA-polymérase III qui synthétise les petits RNA (tRNA, rRNA 5 S, snRNA, 7SLRNA).

Toutes les ARN polymérases des eucaryotes sont des protéines
constituées de nombreuses sous-unités (typiquement de 8 à 14). La plus
grande sous-unité de l'ARN polymérase II a un domaine C-terminal
("carboxy-terminal domain": CTD) qui consiste en une répétition d'une
séquence consensus de 7 acides aminés. Cette séquence répétitive est
propre à l'ARN polymérase II. Chez les mammifères, on démombre environ
50 répétitions de cette séquence consensus. La portion CTD peut être
hautement phosphorylée sur des résidus sérine ou thréonine. Dans ce
chapitre nous nous intéresserons essentiellement à la synthèse des
transcrits primaires des gènes des eucaryotes par l'ARN polymérase II.

Structure des gènes chez les eucaryotes: les exons et les introns.

Chez les eucaryotes, les gènes présentent une structure discontinue,
comportant des exons et des introns. Les exons sont par définition des
séquences d’ADN qui seront traduites en protéines (on dit aussi qu’elles
seront exprimées). Les introns sont par définition des séquences d’ADN
intercalées entre les exons.


Les promoteurs

- Tout d’abord, la boîte TATA.

Elle est située à environ -25 paires de bases de l’origine de la
transcription. C’est une séquence de six nucléotides riche en A et T. La
séquence dite consensus (statistiquement la plus rencontrée) est
TATAAA. Une mutation dans cette boîte altère fortement la transcription.
Cette boîte fixe un facteur général de transcription appelé TFIID (TF:
facteur de transcription; II pour l’ARN polymérase II). Ce facteur est
absolument nécessaire pour l’initiation de la transcription. Puis en
remontant en amont du site d’initiation, on trouve successivement:

- La boîte GC (située le plus souvent dans la région entre -110 et
-40). Elle peut se présenter sous forme d’hexanucléotides: 5’-GGGCGG-3’.
Le motif riche en bases G et C peut être répété plusieurs fois.

- La boîte CCAAT (souvent située dans la région entre -120 et -80).
Cette boîte peut être située avant ou après une boîte GC ou même entre
deux boîtes GC.

L’unité de transcription comporte une origine le point de départ de
la transcription (ou site +1) et un point de fin de la transcription
(séquence de terminaison de la transcription). En d’autres termes, une
unité de transcription va de la première base transcrite à la dernière
base transcrite. L’ARN qui lui correspond s’appelle le transcrit
primaire ou pré-mARN. Il comprend non seulement les régions codantes ou
exons, mais aussi les introns et les portions 5’ et 3’ non traduites
(régions 5’-UTR et 3’-UTR, « UTR= untranslated regions »).

2 ème étape : élongation
- Formation de liaisons ester entre nucléotides, l’énergie de liaison est apportée par les nucléotides eux-mêmes.

- Progression de la transcription 5’ 3’

L’ARN polymérase peut être comparée à un curseur se déplaçant sur l’ADN

Après son passage, il y a restauration de ces liaisons.














Etape 3 : fin de la transcription

- Chez les procaryotes : Signaux de fin de transcription

1° Région à symétrie imparfaite ou palindrome imparfait

2° Région riche en A-T, région plus lâche, permettant à l’ARN polymérase de sortir de transcription.

5’ GCCGCCAC TTCCG CTGGCGGC ATTT 3’

3’ CGGCGGTG AAGGC GACCGCCG TAAA 5’

De plus au niveau du palindrome, se forme une boucle en épingla à
cheveux ( self complémentarité ) ; elle sera responsable de l’arrêt de
la transcription ( plus que la séquence riche en AT).

- Chez les eucaryotes

Le palindrome imparfait se trouve plus en amont

Séquence de fin de gène et( non de transcription ) : AATAAA, cette séquence est lue sur le brin d’ADN non transcrit.

L’ARN polymérase reconnaît ce signal, mais continuera à transcrire au delà.

Les transcrits seront raccourcis par la suite, ils se termineront par la séquence AAUAAA suivie de 10 à 15 nucléotides.

Remarques sur la transcription

- Choix du brin d’ADN copié par l’ARNase ?

C’est la direction de l’ARNase le long de l’ADN qui détermine le choix.

- Amplification des informations contenues dans l’ADN

Pour l’ARNm : 1 gène x ARNm y protéines.

X et y = +/- 1000

Pour ARNr et ARNr : plus de traduction

Conséquence : plusieurs copies identiques d’un même gène.

Les modifications post transcriptionnelles

Chez les procaryotes

ARNr : Précurseur qui sera ensuite clivé pour donner un ARNr stable.

ARNt : Précurseur qui subira :

- Des clivages
- Des additions ( CCA en 3’)
- Des modifications de bases ( bases atypiques).

ARNm : Pas de modifications. La traduction commence avant la fin de la transcription.

- Chez les eucaryotes.

a) Structure de l’ADN des eucaryotes par rapport à celui des procaryotes

L’ ADN d’un gène d’organisme eucaryote se subdivise en séquences appelées « exons » et « introns » qui alternent .

La transcription de ce type de gène appelé gène mosaïque ou en morceaux portera le nom de ARN pré messager ( ARNpm ) ou transcrit primaire.

Ce gène comprend en plus les régions 5’UTR et 3’UTR qui
ne sont pas traduites. Par la suite, par un processus
d’excision-épissage, ce transcrit donnera l’ARN messager qui ne porte
plus que les parties correspondant aux exons ; l’information portée par
les introns ne sera pas traduite.







b) Modifications subies par le transcrit primaire

1° Addition du cap à l’extrémité 5’

Le premier nucléotide du transcrit primaire commence par un groupement triphosphate.

La base correspondante est en principe une base purique (A ou G).

L'extrémité
5’ initiale du transcrit primaire peut alors être représentée par : 5’
pppA/GpNpNpNpN... avec p=groupement phosphate et N=A,T,C ou G.

En présence de GTP et d'une guanylyl transférase, on a la réaction suivante :

Gppp+pppApNpNp...----->GpppApNpNp...+pp+p

Le premier phosphate situé à l’extrémité 5’ du transcrit primaire va
être éliminé au cours d’une soudure (par une liaison anhydride d’acide)
avec du GMP (guanosine
monosphosphate) provenant du GTP. Il y a donc constitution d’une liaison inhabituelle: 5’à 5’ triphosphate. On parle de coiffe ou « cap ».

Cette coiffe en 5’ du transcrit primaire se met en place dès le début de la transcription.

Au niveau de la base de la guanosine terminale s’ajoute un groupement
méthyle sur l’atome d’azote en 7. D’autres modifications peuvent se
produire comme des méthylations en 2’ sur les riboses situés sur les
deux premiers nucléotides de l’extrémité 5’ du transcrit primaire.

Il n’y aura donc plus de 5’ phosphate libre mais un OH libre en 3’ aux deux extrémités

La coiffe est indispensable pour :

- Protéger les mARN de l’attaque par des enzymes de dégradation ( phosphatases,polynucléases).

- Permettre la traduction, pas de cap chez les autres ARN, pas de traduction.





2° Addition de poly A à l’extrémité 3’

Addition de plus ou moins 100 nucléotides à Adénine à l’extrémité
3’.Dés que l’ADN polymérase II a transcrit au delà du bout 3’ de la
séquence codante de l’ADN , l’ARN naissant est scindé au voisinage d’un
site particulier dont la séquence consensus est AAUAAA : ce site est le
site de polyadénylation.La scission se produit en
général à une
distance de plus ou moins 10 à 20 nucléotides en aval de ce signal et
dépend probablement d’autres séquences ainsi qu’éventuellement de la
structure
du précurseur du ARNpm.La nouvelle extrémité 3’ créée ainsi sert
d’amorce à l’addition récurrente d’ une série de résidus adénosine
catalysée par la poly A polymérase.Dans cette réaction utilisant l’ATP,
l’enzyme peut ajouter jusqu'à 250 nucléotides pour constituer un
appendice de poly adénylate connu sous le nom de poly A qui s’associe à
une protéine de 78.000 Daltons.













Les rôles de cette queue poly A seraient de :

- Permettre le passage de l’ARNm du noyau vers le cytoplasme

- Protéger l’ARNm au cours de la traduction.

3° Maturation du précurseur

Dans le noyau : excision des transcrit d’introns et épissage des transcrits d’exons.

Les enzymes d’excision épissage ne sont pas spécifiques du transcrit
d’intron, elles reconnaissent la jonction transcrit d’intron – transcrit
d’exon.

Ce mécanisme se déroule dans le noyau des eucaryotes. Chez les
eucaryotes supérieurs, il a été démontré très tôt que l'ARN nucléaire
était hétérogène et instable. Cet ARN a été appelé ARN nucléaire
hétérogène (hnRNA). La forme physique du hnRNA est celle d'une particule
ribonucléoprotéique dans laquelle le hnRNA est lié à des protéines.
Le transcrit primaire ou pré-mARN est inclus dans l'hnRNA, qui contient bien entendu d'autres transcrits.

Importance de la conservation de séquences situées à la jonction exon-intron.







Au niveau du transcrit primaire: La séquence des bases d’un intron
commence par GU et se termine par AG. La séquence consensus à
l’extrémité 5’ des introns des vertébrés est GUAAGU ou GUGAGU. A
l’extrémité 3’, la séquence consensus est un brin de dix pyrimidines (Py
= U ou C) suivie par n’importe quelle base N (A, U, G ou C) puis par C
(ou U) et se termine par la séquence invariante AG. L’exon d’amont se
termine par CAG ou AAG. L’exon d’aval commence par une base G ou A. Le
site de branchement (A) est localisé entre 20 et 50 nucléotides en amont
du site 3’ d’épissage.

Le mécanisme de l’excision-épissage fait intervenir deux réactions de transestérification.

Dans la première étape, il y a formation d’un premier clivage en 5’
de l’intron. L’OH situé en 2’ du ribose appartenant à l’A du branchement
vient se
souder à l’extrémité 5’-phosphate de l’intron. Il y a
formation d’une liaison 5’-2’ phosphodiester. Il y a constitution d’une
boucle ou lasso (« lariat »). L’extrémité 3’ de l’exon situé en amont du
clivage (exon 1) présente un OH (3’) libre:













Ce
mécanisme doit être tout à fait précis car le moindre décalage d’un
nucléotide modifie le cadre de lecture lors de la traduction : protéine fortement modifiée.



Mécanisme chimique



VI.5 . Le contrôle de la transcription chez les Eucaryotes

III.5 . Le contrôle de la transcription chez les Eucaryotes

III.5.1 Le complexe d'initiation.

A la différence de l’ARN polymérase des procaryotes, l’ARN polymérase II des eucaryotes ne se fixe pas directement sur le promoteur. Elle se fixe par intermédiaire de facteurs généraux de la transcription comprenant plusieurs protéines dénommées TF pour « transcription factor » et II pour l’ARN polymérase II: TFIIA,
TIIB.... Ces protéines associées à l’ARN polymérase II constituent le complexe d’initiation de la transcription et
catalysent la formation de la première liaison phosphodiester entre les
deux premiers nucléotides du mARN. Lorsque le site promoteur est libéré
par la progression de l’ARN polymérase II sur l’ADN constituant la
phase d’élongation, un autre complexe d’initiation peut se mettre en
place.

III.5.1.1 Les facteurs généraux de la transcription et la formation du complexe basal d'initiation

Une succession d’étapes met en jeu des éléments du promoteur, l’ARN polymérase II et des facteurs protéiques généraux de la transcription.

1/. La première étape est constituée par la fixation du facteur de
transcription TFIID sur la boîte TATA. Cette fixation est realisée par
l’intermédiaire d’un des composants du facteur TFIID qui est appelé TBP (
pour « TATA box binding protein »).





Un facteur additionnel TFIIA stabilise l’association facteur TFIID et
boîte TATA. Il n’est pas représenté sur les schémas suivants. Le
facteur TFIID comporte des facteurs appelés TAFII (« transcription
activating factors ») Ces facteurs TAFII permettent l’interaction entre
le facteur TFIIID et des éléments activateurs situés en amont de la
boîte TATA.

2/. Puis le facteur TFIIB se fixe sur le facteur TFIID fixé sur la boîte TATA.


4/. Les facteurs TFIIE et TFII H se fixent, suivis par des facteurs supplémentaires complétant le complexe de transcription:



Le facteur TFIIH présente une activité protéine kinase. En présence
d’ATP, une phosphorylation de l’ARN polymérase est réalisée sur la plus
grosse sous-unité de l’enzyme riche en sérine et en thréonine (partie
C-terminale).

5/. La phosphorylation sur sites spécifiques déclenche le début de la transcription:

De plus, arrivée au bout du promoteur, l’ARN polymérase II doit être
libérée du complexe des facteurs de transcription généraux pour démarrer
la transcription.



La phosphorylation d’une des sous-unités de l’ARN polymérase est
indispensable pour déplacer l’enzyme du complexe d’initiation de la
transcription.

III.5.2 Définition des facteurs CIS et TRANS régulateurs de la transcription

Il
existe toute une série de séquences nucléotidiques comportant chacune
un nombre limité de nucléotides (6-8 nucléotides le plus souvent) et
dispersées généralement en 5’du gène, ces séquences sont appelées éléments cis-régulateurs. Ces séquences sont remarquablement conservées dans les
gènes de nombreuses espèces. Elles vont fixer des facteurs dits trans-régulateurs.

2.1. Facteurs cis-régulateurs de la transcription.

Quand un facteur trans-régulateur se fixe sur une séquence
cis-régulatrice de l’ADN, la quantité de mARN synthétisé est brusquement
modifiée, soit augmentée, soit diminuée. Les séquences activatrices
(séquences « enhancer ») peuvent être situées à des distances très
importantes du promoteur du gène (jusqu’à quelques dizaines de
kilobases) et ceci en amont ou en aval du gène. Des séquences
extinctrices (séquences « silencer ») ont un effet opposé aux séquences
activatrices. Elles peuvent être également situées très à distance du
promoteur du gène. C’est bien entendu la structure tridimensionnelle de
l’ADN qui permet de rapprocher ces
éléments régulateurs du gène à transcrire.

Ainsi, pour nous limiter à quelques exemples, le facteur général de
transcription TFIIID peut être considéré comme un facteur
trans-régulateur. Il se fixe sur un élément cis-régulateur qui est la
boîte TATA.

La boîte GC, élément cis-régulateur va fixer un facteur trans-régulateur, la protéine Sp1.

La boîte CCAAT, élément cis-régulateur va fixer le facteur CTF (« pour CCAAT binding transcription factor »).


2.2. Facteurs trans-régulateurs de la transcription.

Les facteurs trans-régulateurs sont des protéines particulières
produites par d’autres gènes. Ces protéines présentent des
caractéristiques structurales communes,
avec au moins au minimum deux domaines :

- Tout d’abord un domaine de fixation à l’ADN. Des motifs structuraux particuliers ont été décrits avec :

- Les doigts de zinc. Ce type de protéine comporte des éléments
répétitifs avec une forme de doigt de gant. On peut retrouver de
nombreux doigts. Ainsi, la protéine Sp1 qui se fixe sur les boîtes GC
possèdent trois doigts de zinc. L’ion Zn²⁺ sert à stabiliser le motif sous forme de doigt.

- Les glissières à leucine. Les protéines avec glissière à leucine se
fixent à l’ADN sous forme de dimères. Elles possèdent deux régions
importantes. Une région à base du dimère, constituée par deux hélices
alpha face à face riches en leucine et interagissant par des liaisons de
type hydrophobe. Une autre région riche en
charges positives se fixe sur les groupes phosphates de l’ADN.

- Les homéodomaines à charges positives avec des structures
hélice/boucle/hélice, hélice/tour/hélice (voir cours sur les protéines).

Un autre domaine, dit d’action sur la transcription.
On peut rencontrer: différents types de domaines d’activation de la
transcription. Des domaines riches en glutamine, des domaines riches en
proline et des domaines organisés en hélice alpha riches en résidus à
charge négative (hélice alpha-acide).

Certains facteurs trans-régulateurs possèdent un troisième domaine
qui permet de fixer un élément annexe permettant de réaliser l’action
d’un message extérieur à la cellule, comme un message hormonal. On a pu
ainsi définir la superfamille des récepteurs nucléaires
(stéroïdes,vitamines D, hormones thyroïdiennes, acides rétinoïques,
acides gras polyinsaturés...).

Enfin, l’action des facteurs trans peut être elle-même régulée par
d’autres facteurs avec modification des facteurs trans en réponse à une
stimulation extérieure:
phosphorylation, protéolyse etc...

2.3. Approches intégrées.

Nous avons vu qu’il existe des séquences cis-régulatrices situées en 5’ du gène considéré. On les appelle des séquences régulatrices d’amont.
Toute une série de séquences sur lesquels se fixent spécifiquement des
facteurs transcriptionnels (ou facteurs trans) y sont retrouvées en plus
des boîtes GC et CAAT. Au sens strict du mot promoteur d’un gène,
celui-ci correspond à la région où se fixe l’ARN polymérase II (donc au
niveau de la boîte TATA) jusqu’au site d’initiation de la transcription.

Certaines de ces séquences régulatrices d’amont confèrent une
spécificité tissulaire d’expression aux gènes qui les possèdent.
D’autres séquences sont la cible de
facteurs transcriptionnels dont
la fixation ou l’activation sont sous le contrôle de stimulus extra- ou
intra-cellulaires (hormones par exemple). Ces séquences cis de ce type
sont appelées RE (réponse à un élément externe).

On peut donc dire que chaque gène est précédé par une série de
séquences régulatrices d’amont séparées par des séquences non critiques
sur l’activité transcriptionnelle. Le fait qu’un gène peut répondre ou
non à un stimulus donné (par exemple: un choc thermique) dépend de la
présence ou de l’absence de ces séquences. Ainsi, comme autre exemple,
la présence d’une séquence ERE (réponse aux oestrogènes) en amont d’un
gène donné permet à celui-ci d’être systématiquement activé, mais avec
deux conditions supplémentaires: que la cellule possède des récepteurs
pour les oestrogènes et que l’hormone soit présente.

2.4. Importance de la chromatine, méthylation des cytosines.

La chromatine est constitué d'un mélange d'ADN et de protéines. Il
est important de rappeler que la chromatine est facilement observable
après coloration dans les noyaux de cellules à l'interphase. Des
nucléosomes forment un élément essentiel de la chromatine. Il sont
constitués par environ 200 paires de bases d'ADN associées à un octamère
d'histones. Chaque octamère comporte deux copies de chacune des
histones : H2A,H2B, H3 et H4. Les histones H3 et H4 sont parmi les
protéines les plus conservées sur le plan de leur séquence, ceci suggère
que leurs fonctions sont identiques chez tous les eucaryotes. Ces
histones constituent les histones de noyau. Par contre, l'hystone H1
bien que faisant partie du nucléosome peut être enlevée sans affecter la
structure de celui-ci ce qui suggère sa localisation externe. Les
hystones peuvent présenter des modifications transitoires sur certains
groupement de leurs chaines polypeptidiques. Ainsi, des acétylations
ou
des méthylations sont possibles et réversibles sur des résidus lysine.
Des phosphorylations sont également réversibles sur les groupements
OH,particulièrement au niveau de la sérine. Ces modifications sont
transitoires et changent la charge de la molécule ainsi que ses
intéractions avec les groupements phosphates de la molécule d'ADN.
Enfin, des protéines non histones interagissent au niveau de la
chromatine.

Deux états de la chromatine sont importants à connaitre et sont facilement mis en évidence par les colorations spécifiques
-
l'hétérochromatine : ce mot désigne les région du génome qui sont en
permanence dans un état hautement condensé. Ces régions ne sont pas
transcrites et se répliquent tardivement. L'hétérochromatine peut être
facultative ou constitutive. L'hétérochromatine constitutive reste
constamment sous forme condensée et ne contient pas de gène fonctionels.
L'hétérochromatine facultative peut se transformer en euchromatine.

- l'euchromatine est à l'opposé de l'hétérochromatine puisque les
régions correspondantes sont activement transcrites et se répliquent
précocément.

Quand la chromatine est digérée par l'enzyme DNase I, le premier
effet est l'apparition de cassures en des sites spécifiques appelés sites hypersensibles.
Ces sites représentent la disponibilité en ADN dans la chromatine.
L'ADN à ce niveau n'est pas protégé par les octamères d'histones, bien
que ceci n'impliquent pas nécessairement qu'il soit libre de protéines.
Généralement, des gènes activement transcrits sont préférentiellement
sensibles à l'enzyme DNase I. On peut également dire que cette
sensibilité est une caractéristique des gènes qui sont capables d'être
transcrits.

Il a été démontré chez les eucaryotes que les dinucléotides CG (ou
CpG, p pour phosphate) sont souvent méthylés au niveau de la cytosine.
Les génomes chez les eucaryotes ne sont pas méthylés de manière
uniforme. Approximativement, 70 à 80% des sites CpG contiennent des
méthyl-cytosines chez la plupart des vertébrés y compris chez l’Homme.
Les méthylations de l’ADN concernent les régions régulatrices en 5’ des
gènes. Environ la moitié des gènes chez la souris et chez l’Homme
contiennent des ilôts CpG. Ce sont principalement les gènes domestiques
(ou« housekeeping genes »). gènes spécifiant des protéines nécessaires à
des fonctions communes à toutes les cellules, et dont l’expression est
par conséquent ubiquitaire (par exemple, les enzymes de la glycolyse)
qui en contiennent. Cependant, ces méthylations concernent également les
gènes avec une expression tissulaire restreinte.

Les enzymes qui transfèrent des groupes méthyles à la cytosine en
position 5 sur le cycle sont des cytosine 5-méthyltransférases ou DNA
méthyltransérases. L’activité transcriptionnelle de nombreux gènes est
étroitement dépendante de la méthylation de certaines zones de
régulation de ceux-ci. Plusieurs hypothèses
ont été formulées pour
expliquer la répression de l’activité transcriptionnelle par la
méthylation de l’ADN. Il a été évoqué la possibilité d’une diminution
des
interactions entre certains facteurs transcriptionnels et leurs sites
spécifiques après méthylation de ces derniers. Il a été également
suggéré que des liaisons directes entre des répresseurs
transcriptionnels spécifiques et des sites ADN méthylés diminuerait
l’activité transcriptionnelle. Enfin, plus récemment, la modification de
la structure chromatinienne par la méthylation de l’ADN a été proposé.

Seulement 1 à 2 % de l'ADN code pour des protéines

III.6 Rôle des introns

III.6.1 Fonction catalytique

Rappelons qu’ils ont été découverts chez les eucaryotes
supérieurs.Certains procaryotes possèdent des introns dans leurs gènes
(archébactéries).Le rôle des introns est encore discuté. Cependant,
quelques idées semblent émerger. Les introns pourraient faciliter
l’élaboration de gènes complexes en délimitant des séquences codantes et
permettant ainsi la mobilité des exons dans le génome. Enfin, l’absence
d’introns dans un génome bactérien pourrait signifier que la bactérie
est parvenue au stade ultime de son évolution et qu’elle aurait perdu
toute possibilité d’évoluer vers la complexité.

On a également découvert que certains ARN pouvait avoir une activité catalytique, ils sont appelés Ribosymes.

En fait l'ARN possède beaucoup d'atouts lui permettant d'avoir une
activité catalytique appréciable, atouts que l'on retrouve pour la
plupart dans les protéines :


- Structuration en domaines


- Repliement tridimensionnel complexe


- Capacité à fixer des ligands variés ( Aptamères )


- Affinité particulière pour les analogues d'états de transition


- Fixation spécifique d'ions métalliques

Le terme ribozyme désigne donc les ARNs possédant une activité
enzymatique,bien que beaucoup de ribozymes naturels ne catalysent qu'une
fois leur réaction
spécifique et donc ne sont pas en tant que tel des vraies enzymes. Les ribozymes naturels ne sont pas très nombreux et se cantonnent généralement à des
réactions
de clivage / ligation sur les acides nucléiques. Néanmoins ils
fournissent la base de travail pour l'élaboration de ribozymes
artificiels in vitro qui, s'ils n'atteignent pas une complexité
structurale comparable à celle des ribozymes naturels, et donc
n'atteignent pas non plus leur efficacité, permettent d'élargir le
répertoire des activités catalytiques des ribozymes

Les
introns de groupe 1 ont été les premiers ribozymes a être découverts,
par Tom Cech, dans le précurseur de l'ARNr 26S du protozoaire
Tetrahymena thermophilus. Ils
ont la capacité d'autoépissage sans
aucun autre apport exterieur que celui guanosine, phosphatée ou non, et
de l'ion magnésium. Cet épissage est réalisé par 2 réactions de
trans-estérification après l'attaque initiale de la guanosine sur le
site d'épissage 5'.







Schéma récapitulatif des étapes de l'autoépissage
des introns de groupe I


Les différents introns de groupe I, bien qu'ayant peu de similarité
dans leur séquence, ont en commun de éléments courts de structure
primaire. Ces éléments
appartiennent à des domaines indispensables
pour le repliement correct de l'ensemble, amenant à la structure
catalytiquement active. Le site actif de la
catalyse nait ici principalement de 3 éléments :

o Le premier élément important est la création d'une poche de
fixation pour la guanosine, qui peut discriminer entre la guanosine et
les autres nucléosides et qui la
positionne optimalement pour une attaque nucléophile sur le site d'épissage en 5'.

o L'alignement du site d'épissage est réalisé par l'appariement
d'une séquence riche en pyrimidine de l'exon en 5' avec une séquence
guide (IGS pour Internal Guide Sequence) de l'intron.

o Le site d'épissage en 3', bien qu'éloigné dans la séquence, est
aussi présent dans le site catalytique pour permettre lors de la 2ème
transesterification la ligation
des 2 exons et la liberation de l'intron.







III.6.2 Evolution des organismes

Les premiers êtres unicellulaires possédaient un courant
d’information cellulaire qui manquait de précision, d’où la nécessité de
répéter plusieurs fois
un même gène codant pour de petites protéines.

Par la suite, un rapprochement de ces gènes par excision épissage a permis de réaliser des protéines plus grosses aux fonctions nouvelles .

III.6.3 Rôle dans l’excision épissage.

On remarque lors d’expériences de fusion de différentes souches de
levure qu’une mutation au niveau de l’intron peut bloquer la procédure
d’excision épissage d’un gène.

Importance des gènes en morceau dans la physiologie des organismes

Rappel : dans un organisme, toutes les cellules portent les mêmes gènes.

1^er exemple : Cellules des CUB et de l’hypothalamus

Dans ces deux types de cellules, un gène à 6 exons va être transcrit en un même ARNpm.

Dans les cellules des CUB :

L’ARNm se composera des quatre premiers transcrits d’exons plus la
séquence poly A. La traduction donnera le calcitonine, hormone impliquée
dans
le métabolisme phosphocalcique de l’organisme .

Dans les cellules de l’hypothalamus :

L’ARNm se composera des transcrit des exons 1,2,3,5 et 6 plus
séquence poly A.La traduction donnera une autre hormone C.G.R.P (
calcitonine gene related peptide) qui joue un rôle important en
physiologie cardio-vasculaire.

Conclusion : Le choix des sites de coupure dépend des types cellulaires

Source de grande diversité avec une grande économie de moyens

Un gène peut coder pour plusieurs protéines,augmentation de la capacité de codage de l’ADN.

Remarque :
Cette propriété ( épissage alternatif) est à l’origine, en partie , de la diversité des Anticorps circulants.

II.7 Traduction ou synthèse des protéines (protéogénèse)
III.7.1 Le code génétique

L’ARN est une copie aussi fidèle que possible de l’ADN, il porte son information au niveau de quatre bases A U G C.

Comment coder 20 acides aminés différents au moyen de quatre bases différentes ?

Raisonnement :

1 base pour 1 aa : 4 possibilités

Suite de 2 bases pour 1 aa : 4²

Suite de 3 bases pour 1 aa : 4³

Le code sera formé de 64 triplets ou codons

3.4.2 ) Représentation du code 1 ère forme (ADN codant)



Autre présentation du code génétique , 2^ème forme ( ARNm)


Code des acides aminés ( réciproque du code génétique)


Rappel : à un codon correspond un seul acide aminé, à un acide aminé correspondent plusieurs codons, le code est en quelque sorte non bijectif .

Caractéristiques du code : nous nous baserons sur la seconde forme du code

1° Existence de trois codons non sens

C’est à dire non traduisible en acides aminés : UAA, UAG, UGA.

Ce sont des codons de ponctuation ( fin de traduction).

En ce qui concerne les 61 codons restant : deux aa sont codés par un seul codon, il s’agit de Met et Trp et 18 acides aminés sont codés
par plusieurs codons.

2° Le code est universel : quelques rares exceptions

Mitochondries :

AUA pas Ile mais Met.

UGA pas stop mais Trp. (Mycoplasma capricolum également)

AGA pas Arg mais stop.

AGG pas Arg mais stop.

Paramécies :

UAA et UAG pas stop mais Glt ( Paramécium ).

Levures

3° Le code est dégénéré, redondant

Presque tous les aa sont codés par plusieurs codons

Les codons représentant le même aa ne différent que par la troisième base(lettre), voir les quatre codons de la Sérine.

Cette redondance constitue un système de protection vis à vis des
mutations qui peuvent se produire : en effet, les mutations au niveau de
la troisième base n’ont pas d’effet.

4° Le code est non chevauchant

Il était dit que le code génétique était non chevauchant, c’à d que la lecture se faisait de la façon
suivante :

UUU/ACG/AUG/UA…………………

1 2 3 4 codons ( cadre de lecture )
Phe Thr Met ………………….

Ce cadre de lecture reste le cadre de base, mais des exceptions sont apparues, notamment chez les Virus.

III.7.2 Le lieu de la traduction

Le lieu de la traduction est dans le cytoplasme, au niveau des ribosomes . Ces ribosomes sont des sites d’accueil pour les ARNm et les ARNt + aa.

Les ribosomes sont constitués comme nous l’avons vu plus tôt d’ acides ribonucléiques et de nombreuses protéines.

En fait ces ribosomes contiennent deux sites d’accueil pour aa-ARNt (sites P et A)

Parmi ces nombreuses protéines, il y en a une qui joue le rôle d’
« agrafeuse » : elle « agrafe » les aa à la chaîne peptidique. C’est la Peptidyl transférase .

III.7.3 Les éléments nécessaires à la traduction.


- des acides aminés (aa) qui formeront par liaisons peptidiques la structure primaire des protéines.

- ARNm,transcrit final qui apporte l’information.

- Les ARNt ou adaptateur entre ARNm et aa, les aa sont fixés sur eux par une liaison ester riche en énergie

aa + ARNt + ATP--------> aa-ARNt + AMP + 2 Pi


.

III.7.4. Les différentes étapes de la traduction

III.7.4.1 vue globale





III.7.4.2 détails de la traduction.

A) L’initiation

la lecture de l’ARNm se fait dans le sens 5’ 3’

Le codon n°1 est le codon initiateur, AUG ------------ Méthionine.

Il existe deux ARNt différents mais ayant le même anticodon pour transporter Met selon qu’il s’agit :

- D’une Met initiale.
- D’une Met destinée à être incorporée en cour de chaîne.

Chez E.coli, la Met initiale n’a pas son groupe NH₂ libre, il est bloqué par l’acide formique : formyl méthionine ( f.Met).

ARNt-Met a une conformation qui lui permet d’être logé dans le site peptidique du ribosome.


B) L’élongation.


- Accrochage d’un nouveau aminoacyl-ARNt

- Formation de la liaison peptidique

- Translocation du ribosome d’une distance équivalente à un codon.

La protéine est synthétisée depuis l’extrémité N terminale à l’extrémité C terminale.

Larguage du premier ARNt





Le secondARNt peut partir, ensuite réalisation de la liaison peptidique, le ribosome avance et on recommence.

C) Terminaison

- Le dernier codon est toujours un codon ponctuation ou stop. Pas d’ARNt correspondant , ce qui provoque le décrochage de la chaîne polypeptidique.

Une protéine d’un poids moléculaire de 70.000 est formée d’environ 700 aa ( poids moléculaire moyen d’un aa : +/- 100) 700 aa à
assembler …

D) Quelques précisions

a) Revenons à la formation de l’aminoacyl-ARNt

Enzyme :
l’aminoacyl-ARNt synthétase est spécifique de l’aa et de l’ARNt
correspondant, la sélection de l’acide aminé se fait sur base de :

1) La charge de l’aa

2) L’hydrophobicité de l’aa, avec pour exemple la tyr ARNt synthétase qui distingue immédiatement Tyrosine et Phénylalanine

3) Certains traits structuraux propres ( caractère stérique), rôle
important de la tige acceptrice dans l’angle intérieur du L constitué
par l’ARNt.

b) Remarques sur les ribosomes

1) Le ribosome fait partie d’un complexe de traduction constitué de l’ARNm,de l’aaARNt, du ribosome et de facteurs protéiques auxiliaires ( facteurs d’’initiation).

2) Le ribosome ménage dans sa structure des sites de formes particulières :

- Un sillon où loge l’ARNm

- Un tunnel de 10 nm de longueur s’ouvrant à l’endroit où se construit la liaison peptidique et qui reçoit la chaîne protéique.

3) Le ribosome possède deux sites de fixation de l’aaARNt.



c) Formation du complexe d’initiation

Le complexe d’initiation assure le bon choix du cadre de lecture et du bon codon d’initiation.

- Présence d’un codon stop ( procaryotes )

- Présence en plus, environ 10 nucléotides avant le codon AUG d’une
séquence consensus le précédent 5’ AGGAGG3’ ( séquence de SHINE
DALGARNO ) reconnue par la petite sous unité du ribosome ( procaryotes).

- D’autre part, en 5’ du codon initiateur en règle AUG (codant pour
la méthionine), il existe une séquence retrouvée dans de nombreux mARN
de vertébrés appelée séquence consensus de KOZAK: CCA/GCCAUGG. Cette
séquence
facilite l’association entre la petite sous-unité du ribosome et le
mARN. Cette séquence consensus comporte le premier AUG, qui est le codon
le codon initiateur le plus fréquent chez les eucaryotes.

La formation du complexe d’initiation dépend de l’intervention de plusieurs facteurs d’initiation :

- Au nombre de trois chez les procaryotes ( IF-1, IF-2, IF-3 ).

- Au nombre de huit chez les eucaryotes ( sigle e-IF )

Ils catalysent l’assemblage de l’appareil de synthèse protéique au niveau du codon d’initiateur.

d) Formation de la liaison peptidique catalysée par la peptidyl transférase , et grâce à l’énergie apportée par la liaison ester de l’aaARNT.

e) Facteurs de largage

Exemple chez E.coli : RF-1, RF-2,RF-3.

Les codons fin au site A du ribosome ne sont pas reconnus par un ARNt

(UGA, UAG, UGA ). Le
site A va être occupé par RF-3, qui lui même favorisera la fixation au
même site de RF 1 ou RF2 , en fonction du codon stop présent. Après
fixation de RF1 ou de RF 2, il devient possible pour RF-3 d’hydrolyser
un GTP en GDP , ce qui stabilise la fixation de RF 1 ou RF 2.

F ) Bilan énergétique

1) assemblage du complexe d’initiation : GTP ---------> GDP +Pi + E1.

2) Formation de la liaison aa-ARNt riche en énergie : ATP ---------> AMP + 2Pi +E2

3) Positionnement de ARNt-aa au site A : GTP ---------->GDP + Pi +E3

4) Translocation du ribosome ( fixation d’un facteur d’élongation) :GTP ------> GDP + Pi +E4.

5) Utilisation de GTP : GTP--------->GDP +Pi + E5

E1 et E5 sont négligeables par rapport à E2 et E3, en effet , ils
comptent pour la synthèse de toute la protéine, E2 et E3 sont requis pur
chaque ajout d’aa à la chaîne polypeptidique.

BILAN :pour chaque
liaison amide, besoin de l’énergie de 4 liaisons riches en énergie :
dont deux sont apportées par un ATP et deux autres par deux GTP.L’ancrage
intime de ces facteurs de largage , a une influence sur la conformation
de protéines ribosomiales et modifie l’action de la peptidyl
transférase qui va hydrolyser la liaison peptidyl ARNt, corrélativement à
l’hydrolyse d’un GTP en GDP.

C’est le prix à payer pour un fidélité de traduction optimum




3.4.6 Le « Wobble » ou base fluctuante

Le code génétique se compose de 61
codons qui ont un sens. Il faudrait donc s’attendre à trouver dans le
cytoplasme 61 ARNt différents. D’après l’hypothèse du Wobble de Crick,
32 ARNt seraient suffisants pour véhiculer les 20 acides aminés
différents.Un ARNt ne transporte qu’un seul acide aminé mais peu
reconnaître plusieurs codons codant pour un même acide aminé
.La base Wobble serait la première base de l’anticodon, correspondant à
la troisième base du codon, il s’agit d’un appariement non
classique.Ainsi pour l’Arginine, l’anticodon UCU peut reconnaître les
codons AGA et AGG.En faisant le total de tous les Wobble, on arrive à un
total de 32 ARNt et non 61, ce qui représente une économie pour la
cellule. De plus, il semblerait que ces appariements atypiques sont plus
lâches et favorisent une accélération de la traduction.

Il faut comprendre quand le ribosome se
fixe sur l'ARNm pour le lire, on le divise en codons. Les ARNt
(molécules qui apportent les AA au niveau du ribosome pour créer la
protéine) ont un anticodon, c'est une séquence de 3 bases qui se fixe
par complémentarité au codon c'est ainsi qu'un codon correspond à un AA.
Mais la première base de l'anticodon qui se complémente avec la 3éme
base du codon ne suit pas la complémentarité de Watson et Crick), c'est à
dire qu'il peut se complémenter avec une autre base (ce qui explique
la redondance du code génétique). Cette règle est la suivante :


G (première base de l'anticodon) peut reconnaître U/C (3ème base du codon)
I (première base de l'anticodon) peut reconnaître U/C/A (3ème base du codon)

I =Inosine=A désaminée

Anticodon position 1	Codon position 3
I	U,C,A
U	A,G
G	C,U

Différentes recherches son menées dans ce domaine, notamment la
structure secondaire des ARNt. Ces recherches ont permis de déceler des
appariement atypiques encore plus lâches que ceux du type Wobble.
Rappelons qu’à priori, tous les appariements sont possibles.

Les différences d’énergie libre correspondant aux appariements peuvent être évaluées ( méthodes thermodynamiques, fonction α
)
, elles permettent de prévoir et d’expliquer la structure secondaire
des ARNt et … leur structures tertiaires ( repliements de la molécule).

III.7.4.3 Notion de séquence signal et modifications post traductionnelles des protéines

A) Généralités.

Les protéines synthétisées dans une celule peuvent:

- Rester dans le cytosol.

- Intégrer la membrane plasmique ou/et les membranes d’organites intra-cellulaires.

- Etre sécrétées à l’extérieur de la cellule.


Une répartition s’effectue entre ces différentes destinations. Les
protéines destinées à rester dans le cytosol sont synthétisées par des ribosomes non liés à une membrane cellulaire. Les protéines destinées à être sécrétées ou intégrées des membranes sont synthétisées par des
ribosomes liés: soit à la membrane plasmique chez les procaryotes, soit
à la membrane externe du réticulum endoplasmique chez les eucaryotes.

B Quelques précisions


Les protéines sécrétées ou membranaires possèdent à leur extrémité
N-terminale une séquence courte d’acides aminés (une vingtaine en
général) appelée séquence signal.



Cette séquence est particulièrement riche en acides aminés hydrophobes.
Chez
les eucaryotes, au début de la synthèse de ce type de protéines, la
chaîne polypeptidique est insérée dès le commencement de sa synthèse
dans la citerne du réticulum endoplasmique. Cette opération complexe
fait intervenir une reconnaissance spécifique de la séquence signal par
des récepteurs situés sur la membrane externe du réticulum
endoplasmique. Après cette rerconnaissance, la séquence signal est à
l’intérieur de la citerne et la phase d’élongation de la synthèse
protéique se poursuit. La séquence signal sera éliminée dans la protéine
exportée de la cellule par un clivage protéolytique produit par une
enzyme située à la face interne de la membrane du réticulum
endoplasmique.

C. Exemple classique de protéine avec séquence signal, l’insuline


L’insuline est une hormone polypeptidique produite par les cellules de
Langerhans du pancréas. Elle est synthétisée sous forme de pré-proinsuline avec
une séquence signal à son extrémité N-terminale. Cette séquence signal
est ensuite clivée dans le réticulum endoplasmique pour donner de la proinsuline.
Un peptide appelé peptide C sera ensuite clivé dans les granules de
sécrétion issus de l’appareil de Golgi et l’insuline active sera
finalement produite sous forme de deux chaînes polypeptidiques (A et B)
unies par des ponts disulfure (-S-S-).

D. Modifications post traductionnelles des protéines

(Rem : faire la liaison avec le contenu des notes de biologie cellulaire)

De nombreuses modifications sont possibles après la synthèse des protéines. Ces modifications peuvent être réversibles ou permanentes.

Modifications réversibles

Nous
nous limiterons aux eucaryotes. Des groupements phosphates
(phosphorylation) peuvent être ajoutés sur des résidus sérine, thréonine
ou tyrosine. Des groupements acétyles (CH₃-CO-) peuvent être ajoutés par exemple sur des résidus lysine.

Modifications permanentes

Ces modifications permanentes peuvent concerner:

La chaîne polypeptidique.


La chaîne polypeptidique peut être clivée à son extrémité N-terminale
(qui comporte de la méthionine chez les eucaryotes). Ce résidu est en
principe éliminé. Chez les procaryotes, l’extrémité N-terminale qui
correspond à la formyl-méthionine est en principe seulement déformylée.

Les clivages par des enzymes de protéolyse des précurseurs de nombreuses protéines sécrétées rentrent également dans ce cadre.

Formation de ponts disulfure.


La formation de ponts disulfure entre deux résidus de cystéines est un
événement majeur de la formation de la structure des protéines.

Hydroxylation des résidus proline et lysine dans le cadre du collagène

Addition de lipides.

Voir Biologie cellulaire, RE et Appareil de Golgi

Addition de sucres

La plupart des protéines sécrétées possèdent des structures oligosaccharidiques. Ce sont des glycoprotéines.
L’addition des structures oligosaccharidiques peut se réaliser soit sur
des résidus asparagine par des liaisons N-glycosidiques entre le -CO-NH₂ de l’asparagine et un OH de la chaîne oligosaccharidique, c’est une N-glycosylation, soit plus rarement entre l’OH de la thréonine ou de la sérine et un OH de la chaîne oligosaccharidique c’est une O-glycosylation.

V LA REGULATION DE LA SYNTHESE DES PROTEINES

La régulation de la synthèse protéique est une absolue nécessité aussi bien chez les procaryotes que chez les eucaryotes.

IV.1 Chez les Procaryotes

Chez les procaryotes, le contrôle de l’expression des gènes permet
d’adapter la cellule d’une part à ses besoins nutritionnels et
à son
environnement, mais aussi de lui assurer une croissance et une division
cellulaire normales. Il faut adapter la synthèse des protéines en
fonction des besoins ( coût énergétique élevé).

IV.1.1 Régulation au niveau de la transcription.

Il existe ainsi deux types de régulations :

1) Par induction -------------> plus de synthèse.

2) Par répression------------> moins de synthèse.

IV.1.1.1 L’induction

Exemple de l’Opéron lactose

- Bases expérimentales

- On sait que le lactose est hydrolysé en glucose + galactose par une enzyme nommée β galactosidase .

Colonie de Colibacilles :

Si placée dans une solution de glucose, on ne trouve pas de β galactosidase dans le milieu de culture.

Repiquage d’une fraction de la colonie dans un milieu contenant du lactose : On détecte une présence abondante de β galactosidase dans le milieu de culture.

Repiquage à nouveau d’une fraction de cette dernière colonie dans un
milieu ne contenant pas de lactose, mais du glucose.On ne trouve plus de
β galactosidase

Conclusion : La synthése de β galactosidase est induite par la présence de lactose.

Explication : En fait l’utilisation du lactose nécessite la présence de trois enzymes.

La β-galactosidase (gène lacZ). Elle hydrolyse la liaison β1-4 osidique des β-galactosides.

La lactose perméase (gène lacY). Cette protéine membranaire permet l’entrée du lactose dans la cellule.

La thiogalactoside transacétylase (gène lacA).
Son rôle n’est pas bien connu. Elle acétyle les β-galactosides non
métabolisables qui peuvent alors être éliminés hors de la cellule par
diffusion à travers la membrane plasmique.

Le lactose est donc l’inducteur de trois enzymes.

Dans l’opéron lactose, on trouve les trois gènes correspondant aux trois enzymes indispensables à la dégradation du lactose.

Il est constitué de :

1.trois gènes de structure ( lac Y, lac A , Lac Z ).

2.un opérateur

3.un promoteur chevauchant l’opérateur



Ces
trois gènes de structure sont précédés par une région responsable de la
régulation de leur expression. Cette région régulatrice comprend le promoteur et l’opérateur. On trouve également en amont de l’opéron lactose, le gène régulateur (lacI)
qui code une protéine régulatrice. Celle-ci agit en
inhibant l'expression des gènes de l'opéron lactose par
transactivation en se liant spécifiquement sur l’ADN au niveau de
l’opérateur. L'expression de ce répresseur est
constitutive, c'est à dire qu'il est exprimé quelque soient les
conditions de croissance de la bactérie. Par contre, son affinité pour
l'opérateur sera modifiée en présence
de lactose.



Fonctionnement de l’opéron lactose

En présence de glucose ( pas de lactose ), inhibition de la transcription, les trois enzymes n’apparaissent pas.

Les trois gènes de structure sont donc muets, ils sont répressés, réprimés.



Le mécanisme de cette répression est le suivant :

Le gène régulateur possède son propre promoteur qui est distinct de
celui des gènes de structure. Ce gène code pour une protéine: le répresseur.
Le répresseur est un tétramère de sous-unités identiques de 38 000
daltons chacune. Il possède une haute affinité pour l’opérateur. Dans
ces conditions, si le répresseur est fixé sur l’opérateur, l’ARN polymérase ne peut pas transcrire
les gènes de structure car elle ne peut pas progresser vers les gènes de structure à partir de son site de fixation qui est le promoteur.

En présence du lactose, Levée de l'inhibition de la transcription.

Nécessité pour la bactérie de synthétiser trois enzymes pour
survivre, la répression est levée, les gènes sont exprimés , il y a dérépression .

Le mécanisme de la dérépression est le suivant :

l y a dérépression par le lactose. Le répresseur synthétisé
par le gène régulateur est reconnu par le lactose et s’associe avec lui.
Il y a impossibilité de fixation du répresseur sur l’opérateur. Si le
répresseur est déjà fixé sur l’opérateur, il est décroché par
l’inducteur (allolactose).

Dans ces conditions, l’ARN polymérase peut librement transcrire les
trois gènes de structure puisqu’elle peut se fixer sur le promoteur. Il
est important de comprendre que les trois gènes de structure
appartiennent à un système polycistronique. Le mARN formé lors de la transcription code pour les trois protéines (perméase, transacétylase et b-galactosidase).



Présence de Glucose et de Lactose , répression catabolique, régulation positive.

Cultivé
en présence de lactose et de glucose comme source de carbone, E. coli
métabolise d’abord le glucose. La bactérie arrête ensuite temporairement
sa croissance jusqu’à que les gènes de l’opéron lactose subissent
l’induction qui permettra le métabolisme du lactose. Même si le lactose
est présent depuis le début de la croissance bactérienne, la cellule ne
commence pas l’induction des enzymes nécessaires au catabolisme du
lactose avant que tout le glucose présent ne soit utilisé.

Initialement,
ce phénomène a été attribué à la répression de l’opéron lactose par un
catabolite du métabolisme du glucose. On parle de répression par un
catabolite d’où le nom donné à la protéine CAP (" catabolite gene
activator protein " ou protéine activatrice des gènes soumis à la
répression par un catabolite). L’opéron lactose n’est pas le seul opéron
dans E.coli sensible à la répression par un catabolite (opérons galactose et arabinose).


En fait, pour que l’ARN polymérase puisse se fixer au site promoteur,
il faut bien entendu que le répresseur ne soit pas lié au site opérateur
mais aussi que le complexe AMP cyclique-CAP soit lié au promoteur.
La bactérie privée de source de carbone accumule l’AMP cyclique. A
l’opposé en présence de glucose, la bactérie ne possède pas suffisamment
d’AMP cyclique pour lier la CAP. Dans ce dernier cas, le complexe AMP
cyclique-CAP est en quantité insuffisante et l’ARN polymérase ne peut
pas commencer la transcription. Par contre, en présence d’une quantité
suffisante du complexe AMP cyclique-CAP sur le site promoteur, la
transcription peut se dérouler.


On sait (voir transcription chez les procaryotes) que l’ARN polymérase
se lie au niveau du promoteur par l’intermédiaire de sa sous-unité
sigma. Cette fixation de la sous-unité sigma se fait de manière
spécifique et efficace dans le cas de l’opéron lactose si le complexe
AMP cyclique-protéine CAP est fixé préalablement fixé en 5’ du
promoteur.

En conclusion, le complexer AMP cyclique-CAP agit à la façon d’un régulateur positif car sa présence est requise pour l’expression génique. Le répresseur codé par le gène régulateur joue à l’opposé un rôle de régulateur négatif. Sa présence sur le site opérateur empêche la transcription des gènes de structure correspondants.


DONC :

Lorsque les bactéries, par chance, disposent en même temps de glucose et de lactose, la situation se complique !

Le répresseur de l’opéron lactose est
inactivé par l’allolactose, le site opérateur de l’opéron est donc libre
et les gènes pourraient être transcrits. Or, tant que du glucose est
présent, la bactérie va le métaboliser préférentiellement : elle n'a
donc pas besoin des enzymes nécessaires au métabolisme du lactose. Ceci
implique l'existence d'un autre mécanisme de régulation que l'on appelle
la répression catabolique. Ce n'est que lorsque la concentration en
glucose diminue que le métabolisme du lactose devient nécessaire. Un
signal de carence alimentaire est alors déclenché sous forme
d’une augmentation du taux d’AMPc. Cet AMPc forme un complexe avec la
protéine CAP (pour Catabolite gene Activator Protein, ou CRP pour cAMP
Receptor Protein). Ce complexe se lie à l’ADN en amont du site de
fixation de l’ARN polymérase. L’interaction du complexe CAP-AMPc va agir comme un inducteur et augmenter l’affinité de l’ARN polymérase pour le promoteur de l’opéron. Cette régulation positive peut permettre
d'augmenter
d’un facteur 50 la transcription de l'opéron lactose. On comprend alors
qu'en présence de glucose, il n'y a pas de complexes CAP-AMPc
disponibles : le niveau de transcription de l'opéron lactose est donc
très faible.

Conclusion

L'induction de l'opéron lactose nécessite deux conditions, il faut
que le lactose soit présent et que le glucose soit absent. La
transcription de l’opéron lactose est donc sous le contrôle de deux
protéines régulatrices :

le répresseur lac-I qui se fixe au niveau de l’opérateur en absence de lactose et bloque l’ARN polymérase. C'est une régulation négative,

la protéine CAP (ou CRP) qui, sous forme d’un complexe avec l’AMPc, se
lie à l’ADN et permet d'augmenter l'affinité de l'ARN
polymérase pour le promoteur. C'est une régulation positive.

Index.

Allolactose : β-D-galactopyranosyl-(1-6)-β-D-glucopyranose.

AMPc : Adénosine 5’monophosphate cyclique, c’est un second messager intracellulaire qui est formé par l’adénylate cyclase.

ARNm polycistronique : chez les procaryotes, les ARN peuvent contenir l’information nécessaire pour former plusieurs protéines différentes.

β-galactosidase : enzyme qui permet d’hydrolyser le lactose en galactose et en glucose (elle est codée par le gène lacZ).

CAP (ou CRP) : «
Catabolite gene Activator Protein », ou CRP pour «cAMP Receptor
Protein». Cette protéine contrôle l’initiation de la transcription des
gènes du catabolisme qui va permettre d'utiliser d’autres molécules
nutritives quand le glucose est absent.

CAP-AMPc : complexe formé après l’interaction de la protéine CAP (ou CRP) avec l’AMPc.

Inducteur : molécule signal qui en se liant à une protéine régulatrice induit une augmentation de l’expression d’un gène donné.

lac A: gène de l’opéron lactose qui code pour la thiogalactoside transacétylase.

lac I: gène en amont de l’opéron lactose qui code pour le répresseur.

lac Y : gène de l’opéron lactose qui code pour la lactose perméase.

lac Z : gène de l’opéron lactose qui code pour la β-galactosidase.

Lactose : β-D-galactopyranosyl-(1-4)-β-D-glucopyranose.

Lactose perméase : Protéine membranaire qui permet l’entrée du lactose dans la bactérie (elle est codée par le gène lacY).

Opérateur : une région de l’ADN sur laquelle se fixe un répresseur pour contrôler l’expression d’un gène ou d’un groupe de gènes.

Opéron : unité d’expression génétique qui comprend un ou plusieurs gènes et des séquences régulatrices (promoteur
et opérateur) qui régule leur transcription.

Promoteur : une région d’ADN en amont du site d'initiation de la transcription sur laquelle l’ARN polymérase peut se lier.

Protéines régulatrices :
ces protéines interviennent dans le contrôle de l’expression des gènes
en se fixant sur des régions particulières de l’ADN. Elles peuvent
ainsi activer ou réprimer de façon spécifique la transcription des
gènes.
L’action de ces protéines est réversible. On parle également de facteurs de transcription.

Répresseur : protéine qui se lie sur une séquence régulatrice ou sur l’opérateur d’un gène, bloquant sa transcription.

Thiogalactoside transacétylase : cette protéine est codée par le gène lacA, son
rôle physiologique n’est pas bien connu. Elle acétyle les galactosides
non métabolisés par la β-galactosidase, cette acétylation permet ainsi
la difusion de ces sucres à travers la membrane plasmique et leur
élimation hors de la cellule.

Le système est doté d’une certaine souplesse avec répressions et
activations partielles en fonction des concentrations en glucose et/ou
lactose.Dans le cas de l’opéron lactose on dit qu’il s’agit d’un système
de type activation ( induction) : La présence même du lactose ainsi que
l’absence de glucose active le gène polycistronique et provoque
l’apparition de la batterie enzymatique propre à la séparation des
dimères de lactose en glucose et galactose.



4.1.1.2 La répression

Cas de l’opéron Tryptophane

Le tryptophane est un acide aminé
indispensable pour l’homme, ce n’est pas le cas pour les bactéries qui
peuvent le synthétiser.Pour réaliser la synthèse de cet acide aminés,il
faut que se produise tout une série de réactions toutes catalysées par
une enzyme spécifique ( 5 enzymes,5 cistrons). Le Tryptophane est le métabolite terminal .

La synthèse de ces enzyme se réalisera quand la bactérie manque ou n’a pas de Tryptophane à disposition.

Fonctionnement en l’absence de tryptophane.

Le gène régulateur synthétise un répresseur. Ce répresseur
se présente sous forme d’un tétramère dont les 4 sous-unités sont
identiques. Il possède une particularité essentielle. En effet, il ne se fixe pas sur l’opérateur. On l’appelle apo-répresseur. Ce n’est qu’en présence d’un co-répresseur
que le répresseur se fixera sur l’opérateur. En absence de répresseur
au complet (apo-répresseur et co-répresseur) fixé sur l’opérateur, l’ARN
polymérase peut se fixer sur le promoteur et commencer la
transcription.
Dans ces conditions, les gènes de structure seront
transcrits et les enzymes de synthèse du tryptophane seront
synthétisées. Le tryptophane sera produit.

Les opérons qui contrôlent la synthèse des enzymes intervenant
dans l'anabolisme fonctionnent selon le modèle de l'opéron tryptophane
présenté ci-dessous. C'est la liaison entre un aporépresseur et un
corépresseur (le produit de la chaîne de
biosynthèse) qui donne un répresseur actif.



Fonctionnement en présence de tryptophane.


L’addition de tryptophane au milieu de culture entraîne un arrêt de la
synthèse de tryptophane. Cette synthèse est donc réprimée. Le tryptophane agissant comme un co-répresseur se lie au répresseur inactif.
Le complexe ainsi formé peut se fixer sur l’opérateur. Dans ces
conditions, l’ARN polymérase ne peut pas commencer la transcription.
Cette dernière est donc bloquée par le résultat final de l’action des
gènes de structure.

En fait, le fonctionnement de l’opéron tryptophane est plus compliqué,il comporte également des séquences appelées " leader " et
" atténuateur " qui sont situées entre l’ensemble promoteur-opérateur et les gènes de structure.

Lorsque la concentration en tryptophane dépasse un certain seuil,
les molécules en excès jouent le rôle de co-répresseur. La liaison apo-
et co-répresseur donne le répresseur actif qui se lie à l'opérateur. La
synthèse de tryptophane est ralentie ou stoppée.

IV.1.1.3 Comparaison repression-induction

La cellule bactérienne possède utilise donc deux types de mécanismes pour réguler la synthèse de ses protéines :

1) 1^er mécanisme : répression permanente

Répression permanente qui peut être levée sur commande par un inducteur Il s’agit d’une dérépression par induction.

Cet exemple de régulation s’observe en général pour des enzymes qui dégradent

2) 2^ème mécanisme : synthèse permanente

Synthèse permanente, mais qui peut être arrêtée sur commande par le métabolite terminal lui même.

Ce type de régulation s’observe plutôt pour les enzymes de synthèse.

Ex : enzymes de synthèse du Tryptophane.

Ex : β galactosidase.



IV.1.2 Régulation au niveau de la traduction.

Cas de la synthèse des r-protéines

Les r-protéines sont des protéines intervenant dans la structure des ribosomes.

Chez E.coli, le ribosome contient 52 protéines différentes qui sont donc codées par 52 gènes différents.

La fabrication des ribosomes représente pour la bactérie une dépense
d’énergie importante . Pour éviter gaspillage, le métabolisme de la
bactérie va ajuster constamment la production de ribosomes aux besoins.

1.° Les r-protéines en excès bloquent leur propre ARNm

Donc une r protéine :

- Peut se fixer sur un ARNr pour former le ribosome.

- Peut se fixer sur l’ARNm pour bloquer la traduction.

2.° Affinité des r-Protéines à la fois pour ARNr et ARNm

Il existe une ressemblance structurale des sites actifs portés par ces deux ARN ; ressemblance portant sur :

- Séquence nucléotidique

- Structure secondaire, au niveau de ces sites, les ARN sont repliés
pour former une région bicaténaire ayant une forme comparable .

Donc : Concurrence entre les deux ARN pour recevoir la r-protéine

Quand les deux ARN sont disponibles, cette protéine se fixe néanmoins plus facilement sur l’ARNr.

Conclusion :

Le contrôle traductionnel est plus rapide et plus efficace que le
contrôle transcriptionnel qui ne peut avoir effet qu’après élimination
des ARNm préexistants.

IV.1.3 Nature de la reconnaissance acides nucléiques – protéines

IV.1.3.1 Exemples de reconnaissance

• Enzymes de restriction ---------- ADN
  
• Amino acyl ARNt synthétase ------------ ARNt
  
• ARN polymérase ---------- promoteur
  
• Répresseur ---------- opérateur
  

IV.1.3.2 Mécanismes possibles de la reconnaissance

Jusqu’ a plus ample informé, on avance deux possibilités principales

a) Concordance au point de vue stérique

De nature géométrique, il y aurait concordance, harmonie entre symétrie de la protéine et de l’acide nucléique.

Exemple : la reconnaissance répresseur opérateur

Opérateur : Constitué de nucléotides disposés avec une certaine symétrie ( palindrome imparfait )

Image de l’opérateur : prise à plusieurs trous.

Répresseur :
protéine, possédant une symétrie qui reconnaîtra cette séquence à
symétrie particulière comme lui étant spatialement complémentaire

Image du répresseur : prise à plusieurs broches.

b liaisons hydrogène

Entre une acide aminé et une base d’un acide nucléique, il peut exister plusieurs liaisons hydrogène.

Entre l’ adénine et le résidu 3’ asporagine, il peut s’établir deux liaisons de ce type.


Ce qui est remarquable , c’est qu’une protéine soit capable de
reconnaître une séquence de quelques nucléotides sur un acide nucléique
en comptant plusieurs millions.

IV.2 Chez les Eucaryotes

IV.2.1 Expression des gènes

Chez les eucaryotes, tous les gènes de structure ne sont pas transcrits dans toutes les cellules.

Les cellules se sont spécialisées et chaque classe de cellule exprimera différemment l’information génétique.

IV.2.2 Hypométhylation et expression des gènes

Quel est le mécanisme qui permet ou empêche l’expression d’un gène.

IV.2.2.1 La méthylation

Une seule base est méthylable : la cytosine.

Cette base est le plus souvent méthylée dans des séquences du type
CGCG ou encore du type CCGG . Trois % de la cytosine sont ainsi
méthylés.

IV.2.2.2 Conséquences de la méthylation de la cytosine

Cette méthylation de certaines séquences de gènes peut être considérée comme un verrouillage de l’expression.

Cette conclusion provient du fait que l’on constate des schémas tels que celui qui suit :

Cellule x pas de protéine a

Le gène codant pour la protéine est méthylé.

Cellule y synthèse de protéine a

Le gène codant pour la protéine n’est pas méthylé.

Il semblerait que l’hypométhylation serait une condition déterminante
pour , nécessaire mais insuffisante pour déterminer l’expression des
gènes . Pas de règle absolue.

On avance l’explication suivante : Les radicaux méthyl empêcheraient la fixation à cet endroit des protéines nécessaires à l’expression des gènes.

IV.2.2.3 Le rôle de maintenance des ADN méthylases.

Lors de la réplication de l’ADN , ces enzymes devront méthyler certaines cytosines des deux brins fils.

Remarque :

Il est possible que la méthylation joue un rôle dans le processus de cancérogénèse.

Les cancérigènes pourraient être des inhibiteurs des ADN méthylases,
déterminant ainsi une sur expression d oncogènes par rapport aux proto
oncogènes ( taux de méthylation des oncogènes supérieur à celui des
proto oncogènes).

IV2.3 Les séquences d’ADN contrôlant l’expression des gènes.

IV.2.3.1 Les enhancers ou stimulateurs

Ces séquences activatrices agissent sur le promoteur en stimulant l’expression.

Ces séquences présentent les caractéristiques suivantes :

• Elles sont activatrices à distance des gènes ( plusieurs milliers de paires de bases).
  
• Elles sont situées soit en avant soit en aval du gène.
  
• Elles sont régulées par des facteurs diffusibles.
  

Remarque : il est à noter que des protéines virales sont responsables d’une activation généralisée de la transcription.

IV.2.3.2 Les silenceurs ou séquences restrictives

Ces séquences ont des effets opposés à ceux des enhancers, mais elles ont les mêmes caractéristiques



V. LES MUTATIONS

V.1 Définition

Les mutations, sont des accidents, des erreurs qui ont lieu au cours de la réplication de l’ADN ou de la transcription

V.1.1 Erreurs au cours de la réplication de l’ADN

Accidents de copie :

• base mal copiée
  
• Base oubliée
  
• Base supplémentaire ajoutée
  

La conséquence en est la modification de l’ARNm et donc la modification de la protéine correspondante.

V.1.2 Erreur au niveau de la transcription.

C’est moins grave, car chaque ADNm a une durée de vie assez courte.

V.2 Différents types de mutations

V.2.1 Mutations sans changement du cadre de lecture.

- Mutations sans effets « silencieuses » : Remplacement d’un codon par un codon codant pour le même acide aminé.


Ex : UUU----------------> UUC

Phe ----------> Phe ( aa indispensable)

Aucune conséquence .

- Mutations conservatrices

Codon remplacé par un autre codon codant pour un acide aminé similaire, du même groupe.

AAA -------------> AGA

Lys ------------> Arg ( 2 aa indispensables et basiques.)

Peu de conséquences

- Mutations faux-sens

Codon remplacé par un codon donnant un acide aminé chimiquement différent

AAG GAG

Lys Glu

Acide aminé basique remplacé par un acide aminé basique : GRAVE, la protéine est modifiée, protéine anormale.



- Mutations portant sur un codon stop

UGC -------------> UGA

Cys -------------> Stop

Particulièrement grave si cela se déroule en début de chaîne, pas de protéine ou beaucoup plus courte.

Relativement moins grave si en fin de chaîne, protéine presque achevée.

L’inverse est également possible, la protéine sera alors plus longue.

V.2.2 Mutations avec changement du cadre de lecture

- La délétion : base(s) non copiée(s), manquante(s).

C’est d’autant plus grave que le déphasage se produit au début du gène

AUG/GCC/UCU/AAC/CAU/…………………..

Mét Ala Ser Asn His…………………..

AUG/- CCU/CUA/ACC/AU………..

Met Pro Leu Thr Ala………..

- Perte d’une base.

La liaison glycosylique liant dans l’ADN les bases avec le
désoxyribose est relativement labile dans des conditions physiologiques.
A l’intérieur d’une cellule de mammifère, plusieurs milliers de bases
puriques et plusieurs centaines de bases pyrimidiques sont spontanément
perdues dans le génome d’une cellule haploïde et par jour. La perte
d’une base purique ou pyrimidique crée un site appelé apurinique ou apyrimidique (ou site AP).

- Insertion

Une base ajoutée : mêmes effets.

V.3 Exemples de conséquences de mutations.

- Maladies des organismes

Ex : la Drépanocytose, due à une modification d’une chaîne de l’hémoglobine ( remplacement d’un seul acide aminé)

Impossibilité pour cette hémoglobine de véhiculer normalement l’oxygène.

Autres maladies humaines : Mucoviscidose, Phénylcétonurie….

- Evolution des organismes

Les mutations ne sont pas toujours néfastes, il existe des mutations
qui apportent un plus ou une adaptation. Elles constituent un des
moteurs de l’évolution.

V.4 Les agents mutagènes.

Les mutations spontanées sont rares lors de la réplication de l’ADN.

En effet, comme nous l’avons vu, les ADN polymérases possèdent souvent une fonction d’édition ( ADNase I et III ).

V.4.1 Les agents mutagènes chimiques

- Substances chimiques qui transforment les bases

Molécules qui provoquent par exemple des désamination.

Exemple des désaminations oxydatives provoquées par HNO₂



Mais aussi :

- Les agents alkylants. Ils entraînent l’addition de groupes alkyles aux bases (souvent des groupes -CH₃). Les agents alkylants sont

utilisés comme médicaments anticancéreux.

- Enfin, certains agents s’intercalent entre les deux brins d’ADN, ce sont des agents intercalants.
Ils perturbent ainsi la réplication. C’est le cas du révélateur de
l’ADN utilisé dans de nombreux laboratoires de biologie moléculaire: le
bromure d’éthydium ou B.E.T.



V.4.2 Les agents mutagènes physiques

Rayons X , Ultraviolets…

L’énergie des radiations ultraviolettes est absorbée principalement
au niveau des pyrimidines de l’ADN, provoquant une excitation des
électrons et des modifications au niveau des liaisons chimiques.

- Formation de dimères de Thymine , ce qui provoque des distorsions locales sur l’ADN, il devient impossible pour l’ADN polymérase de recopier ces deux thymines

- Formation de ponts entre les brins de l’ADN ou entre des protéines et l’ADN.

Certains agents chimiques (psoralènes par
exemple) ou physiques (UV, radiations ionisantes) peuvent conduire à des
interactions stables (« crosslinks ») entre les deux brins d’ADN. Des
interactions stables peuvent être également observées entre des
protéines et les brins d’ADN.



- Les coupures des brins d’ADN.



Les radiations ionisantes peuvent conduire à des coupures d’un brin d’ADN ou à des cassures des deux brins d’ADN.

V.5 Réparation des dimères de Thymine.

V.5.1 La possibilité de réversibilité des dommages sur l’ADN.

C’est la possibilité de réparer l’ADN la plus simple, mais dans bien
des cas elle est impossible à réaliser pour des raisons cinétiques et /
ou thermodynamiques. Dans certains cas, des enzymes spécifiques comme les photolyases
peuvent transformer réversiblement un ADN lésé avec présence de dimères
pyrimidiques en un ADN normal en absorbant de la lumière. Les
photolyases sont présentes dans les bactéries, les plantes, les
champignons mais elles sont absentes chez les mammifères.

V.5.2 Correction des erreurs d’appariements.

Beaucoup d’erreurs d’appariements (ou « mismatches ») sont dues à des
erreurs au cours de la réplication de l’ADN. Cependant, des erreurs
d’appariements peuvent être également produites à la suite d’une
désamination de la 5’-méthyl cytosine pour produire de la thymine qui ne
s’apparie pas correctement avec G.

Chez E. coli, la présence d’un mauvais appariement localisé est décelée par une protéine spécifique appelée protéine MutS.
La protéine MutS reconnaît des erreurs d’appariements mais aussi des
insertions ou des délétions de quelques nucléotides. Une protéine
supplémentaire, la protéine MutL stabilise le complexe formé entre MutS et la portion d’ADN double brin qui présente le mauvais appariement. Ce complexe va activer une protéine MutH
qui va couper le brin nouvellement synthétisé. Il est remarquable que
ce système de coupure différencie le brin parental et le brin
nouvellement synthétisé. En effet, dans l’ADN d’E. coli, les séquences
GATC sont normalement méthylées. Dans le brin nouvellement synthétisé,
la méthylation n’est pas immédiatement réalisée. La protéine MutH va
couper le brin nouvellement synthétisé à l’opposé de la séquence GATC
méthylée du brin parental. Une coopération avec la protéine uvrD
(hélicase II) est nécessaire. Le brin nouvellement formé est alors
partiellement dégradé et resynthétisé correctement par l’ADN polymérase
III. La soudure finale est assurée par l’ADN ligase.

Les organismes eucaryotes possèdent de nombreux systèmes de
réparation des erreurs d’appariements. Ainsi, certains malades atteints
d’une forme héréditaire de cancer du colon (syndrome de Lynch)
présentent des mutations dans les gènes des enzymes de réparation des
erreurs d’appariements. Ces enzymes corrigent les erreurs de réplication
apparaissant au niveau de zones de répétition de séquences
nucléotidiques courtes en tandem qui sont appelées les microsatellites.

V.5.3 la réparation par excision resynthèse

Ce système de réparation est présent chez les eucaryotes et les procaryotes.

Ce type de réparation est communément utilisé pour éliminer les bases
incorrectes (comme l’uracile) ou les bases transformées par des agents
alkylants. Il comprend trois étapes successives:



- Tout d’abord, une élimination de la base incorrecte par une ADN N-glycosylase avec apparition d’un site AP.



- Puis, une coupure du brin d’ADN
endommagé en 5’ du site AP par une endonucléase, créant ainsi un -OH
(3’) adjacent au site AP.



- Enfin, l’extension à partir de cet -OH (3’) par une ADN polymérase est réalisée avec excision du site AP.



La soudure finale est assurée par une ADN-ligase.

De nombreuses ADN N-glycosylases sont caractérisées actuellement (E.
coli). Ces enzymes sont spécifiques de tel ou tel type de lésion au
niveau d’une base lésée (par exemple: formation de la 5-méthyl
cytosine).

Nous avons vu que chez les mammifères et l’Homme, les doublets
nucléotidiques CG peuvent être méthylés au niveau de la cytosine et que
cette méthylation était en relation directe avec l’inactivation des
gènes correspondants. La désamination des cytosines méthylées aboutit à
la formation de la thymine. Une ADN glycosidase particulière reconnaît
spécifiquement le mésappriement TG et élimine T. Cependant, l’efficacité
de ce système est loin d’être parfaite. Souvent, les mutations
ponctuelles de l’ADN concernent ces cytosines méthylées, on parle de points chauds de mutation.

V.5.4 L’excision-réparation de nucléotide.

Bien que l’excision-réparation de base joue un rôle très important
comme processus de réparation de l’ADN, elle ne peut pas suffire à
corriger toutes les erreurs dans l’ADN. En particulier, la disponibilité
des ADN N-glycosylases ne peut pas être étendue à toutes les
altérations possibles des bases de l’ADN. Un autre mécanisme plus
flexible de réparation est impliqué. Ce mécanisme est appelé excision-réparation de nucléotide. Il est disponible dans tous les organismes vivants et il implique les étapes suivantes:

- Tout d’abord, la reconnaissance du dommage sur l’ADN.

- Puis une liaison d’un complexe multi-protéique avec le site endommagé.

- Une double excision du brin endommagé suit avec coupure plusieurs nucléotides en 5’ et en 3’ de celui-ci.

- La portion oligonucléotidique contenant la lésion est dissociée entre les deux points de coupure 3’ et 5’.

- La lacune présente est comblée par une ADN polymérase.

- Une soudure finale est ensuite assurée par une ADN-ligase.

Chez E. coli, trois protéines, les produits des gènes uvrA, uvrB et uvrC sont
responsables de la reconnaissance du dommage et de la coupure de l’ADN.
Le modèle actuel implique la formation initiale d’un complexe entre
deux molécules de la protéine uvrA et une molécule de la protéine uvrB
et ceci avec hydrolyse d’ATP. Ce complexe se lie avec l’ADN
préférentiellement au niveau de la zone endommagée. Il est possible que
l’ADN endommagé soit reconnu par une distorsion de la double hélice
comme c’est le cas d’une courbure de la double hélice induite par les
dimères de thymine. Après liaison de l’ADN avec la protéine uvrB, la
protéine uvrA est relâchée. Une autre protéine uvrC se lie avec la
protéine uvrB, ceci entraîne une coupure en 5’ (7 nucléotides avant le
dommage) et en 3’ (4 nucléotides après le dommage). Ces étapes demandent
la fixation de l’ATP, mais pas son hydrolyse. Une quatrième protéine
intervient, produit du gène uvrD, qui est une hélicase II, elle déplace
l’oligonucléotide endommagé. La protéine uvrB est déplacée dans l’étape
suivante quand l’ADN polymérase I (ou l’ADN polymérase II en l’absence
de l’ADN polymérase I) comble la lacune résultante. La soudure finale
est assurée par une ADN-ligase.

Un tel système de réparation existe également chez les cellules
eucaryotes. On connait d’ailleurs chez l’Homme, des anomalies génétiques
du système de réparation par exicision-réparation responsables de
maladies génétiques graves, nous citerons parmi elles, la xérodermie
pigmentaire (entraînant une sensibilité accrue aux rayons solaires et
une augmentation du risque de cancers cutanés), mais aussi le syndrome
de Bloom ou la maladie de Fanconi.

V.5.5 Les réparations post-réplicatives.



Si le système de réparation par excision-resynthèse de l’ADN est
débordé, et surtout si les zones d’ADN à réparer coincident avec la
présence de fourches de réplication, il est évident que le brin porteur
de la lésion devient impropre à servir de matrice. Dans de telles
conditions, le brin parental contiendra un dimère de thymine et l’autre
brin fils contiendra une lacune, on parle de lacune post-réplicative. C’est une lésion grave de l’ADN.

Pour traiter de telles lésions, un système de réparation approprié va
être mis en oeuvre. Il s’agit du système des protéines Rec (pour
Recombinaison). Ce système de réparation fait donc intervenir une recombinaison.
La recombinaison correspond à un échange d’ADN ente deux segments
homologues. Cette correction fera également intervenir le système de
réparation par excision-resynthèse de l’ADN. Chez E. coli, la production
de la protéine de recombinaison appelée RecA est réduite dans les
conditions normales. Ceci est lié à une répression de la synthèse par un
répresseur protéique appelé LexA (voir contrôle de la transcription).

V.5.6 Le système S.O.S.

Le système S.O.S. a été décrit initialement chez les bactéries. Il
concerne au moins une vingtaine de gènes dont les produits protéiques
sont impliqués dans les mécanismes de réparation et de recombinaison. Ce
système est remarquable parce qu’il est inductible, c’est-à-dire mis en
oeuvre par l’agression physique ou chimique. La protéine de
recombinaison RecA joue un rôle central dans un tel mécanisme de
sauvegarde. La synthèse de cette protéine est normalement réprimée par
une protéine appelée LexA ou répresseur. Si un besoin important de
protéine RecA apparaît, la répression est levée grâce à une propriété
particulière de la protéine RecA qui est capable de cliver son
répresseur ( activation de sa propriété protéolytique ).

La réponse S.O.S se réalise en temps très court , avec pour conséquence, une réparation imparfaite de l’ADN :



- Non respect de la règle de complémentarité



- Suppression de la fonction d’édition.



Conclusion : Pas de blocage de la synthèse d’ADN, pas de mort cellulaire, mais apparition de mutations nombreuses.

C’est le prix de la survie

Les systèmes de réparation post réplicative et S.O.S ne sont pas mis en évidence pour le moment chezl’homme



Croquis illustrant ce chapitre

merçi pr vos efforts pr fournir des information .allah yjaziiiiiiik