TP Biochimie Chromatographie

I. Partie théorique :

1. DEFFINITION DE LA CHROMATOGRAPHIE :

Technique
d'analyse chimique utilisée pour séparer les constituants d'un mélange.
Cette technique est fondée sur le principe de l'adsorption sélective
des différents constituants (phase mobile) sur une phase fixe ou sur
leur partage en présence de phases liquides ou gazeuses. La
chromatographie fut découverte en 1906 par le botaniste russe, Mikhaïl
Tsvet, mais il fallut attendre les années 1930 pour qu'elle soit
largement utilisée. Tsvett avait constaté la séparation des constituants
colorés de la chlorophylle brute lorsque sa solution montait le long
d'un papier filtre. Les différents constituants formaient en effet des
bandes de couleurs distinctes à des hauteurs différentes.

2. CHROMATOGRAPHIE EN PHASE GAZEUSE (CPG) :

Elle
est assez récente et permet de séparer des mélanges de gaz ou de
composés vaporisables à haute température. Le mélange à analyser est
injecté dans une colonne métallique de quelques millimètres de diamètre,
enroulée sur elle-même et contenant la phase fixe. Les composés sont
véhiculés sous pression par un gaz inerte, le gaz vecteur. Il s'agit de
l'hélium ou de l'argon. Le temps que met un constituant gazeux pour
parcourir la colonne est son temps de rétention, qui est caractéristique
du composé. Les constituants sont ainsi séparés par la différence entre
leurs temps de rétention respectifs. Le choix de la phase stationnaire
est déterminant pour la réussite de la séparation. Cette phase est
choisie selon sa porosité et ses interactions avec la phase mobile, qui
dépendent en particulier de la différence de polarité entre les deux
phases. La chromatographie en phase gazeuse est un moyen de séparation
très efficace. Elle est utilisée dans les raffineries et dans
l'industrie chimique. On peut la coupler avec la spectroscopie de masse
pour séparer puis déterminer la nature et la masse des constituants d'un
mélange vaporisé.

3. CHROMATOGRAPHIE EN PHASE LIQUIDE :

Il existe différents types de chromatographie en phase liquide :

3.1 Chromatographie par adsorption :

L'appareillage
est constitué d'une colonne en acier inoxydable, remplie de particules
solides de diamètre inférieur à 20 µm. Cet adsorbant est en général
l'alumine ou le gel de silice. Quelques micro litres de la solution à
analyser sont introduits en tête de colonne. Les constituants séparés en
sortie de colonne sont détectés par spectroscopie UV ou par
réfractomètre. Comme son nom l'indique, cette chromatographie est fondée
sur l'adsorption sélective des constituants liquides sur la phase
solide de la colonne. En fait, il se produit une succession
d'adsorptions et de désorptions, ces dernières étant provoquées par
l'ajout d'un solvant en fin de séparation.

3.2 Chromatographie de partage liquide-liquide :

Elle utilise la différence de solubilité des constituants vis-à-vis de deux liquides non miscibles.

3.3 Chromatographie par perméation de gel (GPC) :

C'est
une méthode qui a subi un fort développement ces dernières années. Elle
utilise la différence de pénétration des constituants sur un gel de
polymère. Les molécules dont le diamètre est inférieur à une certaine
valeur sont les seules à pouvoir pénétrer dans les pores du gel et sont
donc retardées dans leur traversée de la colonne. Les composés sont
ainsi séparés selon la taille de leurs molécules.

3.4 Chromatographie par échange d'ions :

Elle
utilise l'échange d'ions entre la phase fixe, résine constituée d'ions,
et la phase mobile préalablement ionisée. Les ions sont en général des
acides, des bases ou des cations métalliques. La chromatographie par
échange d'ions est employée pour des substances ionisables, en
particulier en chimie minérale.

3.5 Chromatographie sur papier :

Le
mélange à analyser est préalablement mis en solution. On dépose une
petite tache de ce mélange liquide sur une feuille de papier. Le solvant
migre par capillarité, entraînant avec lui les différents constituants,
qui s'arrêtent plus ou moins loin de la tache initiale selon leur
interaction avec la cellulose du papier.

3.6 Chromatographie sur couches minces ( CCM) :

C'est
une technique semblable à la chromatographie sur papier, la phase fixe
étant une fine couche d'adsorbant déposé sur une plaque de verre.

La
chromatographie est largement utilisée en laboratoire et dans
l'industrie pour l'analyse des aliments, des stupéfiants, des produits
pétroliers et des produits de fission radioactive.

La chromatographie des sucres par CCM. On à vue l’exemple du SACCHAROSE.

4. SACCHAROSE :

Le saccharose est un sucre de formule chimique C₁₂H₂₂O₁₁,
appartenant au groupe de glucides connus sous le nom de disaccharides.
C'est le sucre de table ordinaire, extrait de la betterave sucrière et
de la canne à sucre. Il est soluble dans l'eau et dans une moindre
mesure dans l'alcool et l'éther. Lorsqu'il cristallise, le saccharose
forme de longues aiguilles minces faites de cristaux dextrogyres (qui
dévient vers la droite le plan d'une lumière polarisée). Soumis à une
hydrolyse, le saccharose donne un mélange de glucose et de fructose,
deux sucres lévogyres (qui dévient vers la gauche le plan d'une lumière
polarisée). Le mélange obtenu est de ce fait appelé sucre inverti et le
processus correspondant inversion. L'inversion s'effectue dans
l'intestin des êtres humains à l'aide de deux enzymes, l'invertase et la
sucrase. Lorsqu'il est chauffé à des températures supérieures à 180 °C, le saccharose se transforme en une substance amorphe, brune et sirupeuse appelée caramel.

II. Partie pratique :

a) But de manipulation :

L’objectif de cette manipulation est de séparer les constituants du Saccharose.

b) Principe :

La
règle de base est la suivante : Pour séparer deux composés, on exploite
leur différence de répartition entre deus phases ( Stationnaire et
Immobile).

c) Le matériel utilisé:

· Plaque de gel de silice

· Sèche cheveux

· Cuvette à révélation

· Une grosse pince

· Eprouvette

· Entonnoir

· Cuve ( ou Becher) de 250 ml avec couvercle

· Papier filtre

d) Réactifs utilisés :

Ø Le solvant à chromatographie des glucides, constitué de :

60% de méthyle- éthyle- cétone

20% d’acide acétique glacial

20% de méthanol

Ø Le révélateur, composé de :

2% de permanganate de potassium

4% de carbonate anhydre de sodium

Ø Solution d’HCl à une foie normal pour hydrolyser le saccharose

Ø Solution de glucose, saccharose et de fructose à 20gr/l

e) Mode opératoire :

Il y on à 5 étapes, ce sont :

1. Hydrolyser le saccharose :

® Le
réactif le plus utiliser ( fréquenter) pour casser la liaison entre le
glucose et le fructose c’est l’HCl ( Cette étape dure 30 minutes à
température de 100°C).

2. Préparation du solvant :

l Mélanger 20% d’acide acétique glacial, 20% de méthanol et 60% d’un mélange entre méthyle- éthyle- cétone.

l Verser le mélange ( solvant) dans une cuve jusqu’à obtention plus ou moins un centimètre de hauteur.

l Fermer la cuve avec le couvercle.

l Tromper le papier filtre dans la cuve pendant un quart d’heure pour saturer l’atmosphère.

3. Manipulation :

A l’aide d’un crayon, on trace un trait de 1.5 cm au bord inférieur sur la plaque de gel de cilice. Puis on place 3 repères équidistants ( à distances égales).

A
l’aide d’une micro pipette ou seringue, on dépose sur les repères
tracés précédemment 3 fois une goutte de chaque solution de sucre afin
que chaque dépôt soit suffisamment concentré.

Sécher entre chaque dépôt on utilisant un sèche- cheveux.

Mettre la plaque dans la cuve ( les dépôts doivent être au-dessus du solvant).

Fermer la cuve avec le couvercle et laisser migrer jusqu’à ce que le font du solvant est environ 1cm du haut de la plaque.

4. Préparation du révélateur :

® Verser
10ml de permanganate de potassium à 2% dans une éprouvette à l’aide
d’un entonnoir puis verser le même volume ( c’est à dire 10ml) de
carbonate anhydre de sodium à 4%.

® Verser le mélange ( révélateur) dans une cuvette à révélation.

5. Révélation :

® Sortir la plaque de la cuve.

® Sécher la plaque en utilisant le sèche- cheveux jusqu’à disparition complète de l’odeur d’acide acétique.

® Plonger la plaque dans le révélateur à l’aide d’une pince en recouvrant le gel de silice pendant 10 secondes environ.

® Relever la plaque du révélateur et sécher à nouveau

f) Dessin de la plaque de chromatographie en utilisant le papier transparent:

g) Interprétation du résultat:

En général : Rf = d /D

D’après la plaque : D = 6,4 cm

1. Calculer le Rf du glucose ( témoin) :

Rf _glucose = d glucose /D

Rf _glucose = 3,1 /6,4

Rf _glucose = 0,484

2. Calculer le Rf du fructose ( témoin) :

Rf _fructose = d fructose /D

Rf _fructose = 3,1 /6,4

Rf _fructose = 0,437

3. Calculer le Rf du saccharose ( échantillon) :

Normalement
sur la plaque on observe deus points pour le saccharose ( Rf’ et Rf’’).
Mais malheureusement on à pas eu cette chance.

Il n’à apparu qu’un seul point ( Rf’).

Rf’ _saccharose= d saccharose /D

Rf’ _saccharose= 2,8 /6,4

Rf’ _saccharose= 0,437

Le Rf’ correspond au Rf fructose. Alors le point apparu n’est donc que le résultat du fructose seulement.

h) Discutions:

Normalement
le saccharose laisse migrer deus substances ( 2 points). La première
est celle du glucose, l’autre est celle du fructose.

Dans
notre expérience n’est apparu qu’un seul point ( c’est à dire qu’une
substance migrée). Ce problème est dû probablement de l’hydrolyse du
saccharose ( soit une erreur dans la normalité d’HCl ou bien dans la
température).

III. CONCLUSION :

L’avantage
le plus important d’une séparation par chromatographie sur une couche
mince c’est qu’il est très efficace. Un seul passage permet de séparer
plusieurs échantillons à la fois. Mais il est nécessaire de suivre les
étapes mentionnées ci dessus.

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