EXAMEN DE TP/TD - Biologie animale

I - On se propose de déterminer le pouvoir
angiogénique d'un nouveau facteur appelé facteur X sur des
cellules endothéliales en culture. On utilisera pour l'analyse
les cellules hMVEC (human microvascular endothelial cells).


a) Définir le terme angiogenèse. Donner brièvement les
différentes étapes du processus angiogénique.'


b) Grâce à un test approprié on révèle le pouvoir
pro-angiogénique du facteur X. Décrire une méthode permettant
l'obtention d'un tel résultat (décrire le protocole utilisé et
les résultats obtenus avec le facteur X).


II - Dans le but de détailler le mécanisme induit par
le facteur X, on va étudier son effet sur la prolifération des
cellules hMVEC.


a) Dans un premier temps, afin de mieux connaître le modèle
utilisé, on se propose de déterminer la durée des phases du
cycle cellulaire des cellules hMVEC. On réalise d'abord une
coure de croissance. La vitesse de croissance d'une population de
cellules à croissance exponentielle a été déterminée en
comptant le nombre de cellules présentes dans des échantillons
de milieu de culture, à divers temps (voir figure 1).


Afin de déterminer la durée des différentes phases du
cycle, sur la même population de cellules asynchrones
(distribuées au hasard sur l'ensemble du cycle cellulaire), en
croissance exponentielle, on réalise un marquage à la thymidine
tritiée (3H Thymidine) puis les cellules sont fixées. Après
révélation et comptage, on dénombre 422 cellules recouvertes
de grains d'argent sur 1200 cellules comptées. Sur les 1200, on
a pu également compter 60 cellules présentant un motif de la
mitose, facilement reconnaissable au microscope. Enfin grâce à
une analyse un peu plus poussée, on a pu déterminer que 45% des
cellules de cette population en croissance exponentielle étaient
en phase G1.


A partir de toutes ces informations, déterminer la durée de
chaque phase et la durée totale du cycle cellulaire des cellules
hMVEC.


b) Afin d'étudier l'effet du facteur X sur la prolifération
des cellules endothéliales, on bloque le cycle cellulaire par un
double blocage à la thymidine. Puis on lève le blocage par un
changement de milieu dans lequel on ajoute ou non le facteur X
pendant 10h. Après un marquage au iodure de propidium, les
cellules sont analysées par FACS. Les résultats obtenus sont
présentés ci-dessous (figure 2).


Que peut-on conclure après analyse des différents graphes?


c) A partir des résultats obtenus ci-dessus, donner l'allure
approximative d'un histogramme représentant la prolifération
des cellules hMVEC en présence et absence du facteur X. Pour
l'expérience on part dans les deux cas de .5000 cellules et on
les dénombre après 20 et 40 heures.


III - Toujours dans le but de détailler le mécanisme
induit par le facteur X, on va étudier son effet sur la
migration des cellules hMVEC.


a) On utilise pour cela la méthode du ''wound healing assay''
qui consiste à faire une blessure dans une monocouche de
cellules. On peut ainsi observer la migration des cellules dans
l'espace de la blessure. Le tableau ci-dessous résume les
résultats obtenus c'est à dire la distance parcourue (en
millimètre) par les cellules depuis le bord de la blessure en
fonction du temps (en heure).


Que peut-on déduire de ces résultats expérimentaux?


b) On désire visualiser le cytosquelette d'actine lors de la
migration des cellules hMVEC. Comment pensez-vous réaliser
l'expérience?


IV- Résumer les propriétés du facteur X sur les
cellules endothéliales hMVEC.








Figure1: Augmentation du nombre de
cellules hMVEC en fonction du temps.


Figure 2: Graphes obtenus par
Fluorescence Analysas Cell Sorter (FACS), avant et après le
double blocage par la thymidine, puis après 10h de culture en
absence ou en présence de facteur X sur la population de
cellules synchronisées par la thymidine.








source:
[size=9]http://membres.multimania.fr/xloba/exams/ue3TD/ue3TD.htm
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